目的:探究活动性肺结核(ATB)患者外周血中前体耗竭T细胞(Tpex)与终末耗竭T细胞(Tex)基因表达谱的差异。方法:纳入2021年1月至2022年10月于无锡市第五人民医院确诊为ATB的25例患者，同时纳入13例结核潜伏感染(LTBI)者和10名健康对照者。采用流式细胞术分析3组人群外周血中Tpex与Tex的比例。采用流式荧光激活细胞分选术分选ATB患者外周血单个核细胞中的Tpex和Tex亚群；对其进行RNA转录组学测序，筛选上调和下调的差异表达基因；对差异表达基因进行基因本体富集分析，寻找影响细胞代谢及功能的调节通路。统计学分析采用威尔克科森配对样本符号秩和检验、Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。结果:ATB患者的Tpex比例为2.86%(1.74%)，低于Tex的7.93%(6.16%)，差异有统计学意义( Z＝－3.91, P<0.001)；LTBI者的Tpex和Tex比例分别为9.47%(6.26%)和7.43%(5.48%)，差异无统计学意义( Z＝－0.93， P＝0.345)；健康对照者的Tpex和Tex比例分别为8.42%(2.69%)和6.49%(5.14%)，差异无统计学意义( Z＝－1.36， P＝0.170)。3组的Tpex比例差异有统计学意义( H＝21.93， P<0.001)，其中ATB患者的Tpex比例低于LTBI者和健康对照者，差异均有统计学意义( Z＝4.16， P<0.001； Z＝3.34， P＝0.003)。3组Tex的比例差异无统计学意义( H＝2.17， P＝0.338)。与Tex相比，Tpex上调表达B细胞淋巴瘤2等记忆分子基因，下调表达淋巴细胞激活基因3等耗竭分子基因；在细胞代谢方面，Tpex上调表达线粒体蛋白复合物基因、线粒体基质基因、氧化磷酸化基因，下调表达糖酵解相关基因。丙酮酸代谢通路在Tex中上调表达，CD4 ＋T淋巴细胞的激活和分化、糖酵解相关通路在Tpex中下调表达。 结论:在ATB患者中，与Tex相比，Tpex表达更多记忆细胞的特征，以及更少耗竭分子特征，而且线粒体功能保存完好。

目的:基于转录组测序（RNA-Seq），分析比较非酒精性脂肪性肝炎（NASH）早期小鼠模型中Yes相关蛋白（YAP）阳性肝细胞和YAP阴性肝细胞的差异表达基因（DEGs），初步了解此类YAP阳性肝细胞的功能学特征。方法:蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饲喂C57BL/6小鼠2周构建NASH早期模型，对照组为正常饮食。肝组织行苏木精-伊红（HE）、天狼星红染色和病理学评分；免疫组织化学（IHC）观察YAP、p-YAP在肝组织的表达。胶原酶灌注联合Percoll密度梯度离心获取活率大于90%的原代肝细胞。进行YAP抗体标记、流式分选获得YAP阳性和YAP阴性肝细胞并进行RNA-Seq。测序结果用GO、KEGG和相互作用网路的分析方法筛选DEGs。RT-PCR验证模型组肝组织中YAP以及部分DEGs的表达水平。两样本均数比较采用独立样本 t检验。 结果:与对照组相比，MCD诱导小鼠2周的HE染色肝组织可见脂肪变（病理评分1.07±0.21），伴有小叶炎症（病理评分1.13±0.32）和肝细胞气球样变（病理评分0.80±0.20），天狼星红染色未见明显肝纤维化（病理学评分0.40±0.40）。IHC显示NASH早期的部分肝细胞YAP表达为阳性。RNA-Seq分析，YAP阳性和YAP阴性的肝细胞分别得到Clean reads为49 310 604条、54 820 036条。与YAP阴性肝细胞相比，YAP阳性肝细胞导致5 565个基因差异表达，包括上调基因1 662个，下调基因3 903个。上调基因的GO分析显示，嘌呤三磷酸核苷和三磷酸核苷等线粒体功能相关的代谢过程为显著富集的生物学过程（BP）；下调基因分析到显著富集的BP为嗅觉受体相关过程。KEGG分析显示，DEGs富集到292条通路，氧化磷酸化（OXPHOS）通路为显著富集信号通路。RT-PCR确认炎症因子（白细胞介素-1β、白细胞介素-6）、YAP及其靶基因（Cyr61、Ankrd1）以及OXPHOS通路的Cox5b、Sdhc基因水平显著上调，与测序结果一致。相互作用网络分析预测到8个关键基因。结论:NASH早期肝细胞代谢水平的变化可能与YAP活性增加有关。

目的:单细胞RNA测序解析普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中CD34 +细胞的类型与功能。 方法:该研究为实验研究。构建CD34 +细胞谱系追踪小鼠，实现CD34 +细胞在荧光条件下可视化。取6只7~8周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为糖尿病组），腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病模型，于小鼠13周龄时在其背部制备全层皮肤缺损创面；另取6只13周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为对照组），在其背部制备全层皮肤缺损创面。伤后4 d，分别收集对照组3只小鼠和糖尿病组2只小鼠创面组织，消化制备单细胞悬液，采用荧光活化细胞分选法筛选出CD34 +细胞后进行单细胞RNA测序，采用R语言的Seurat 4.0.2程序通过降维可视化和细胞聚类分析CD34 +细胞类型并筛选注释各CD34 +细胞亚群的标记基因，对2组小鼠创面组织间CD34 +成纤维细胞（Fb）、平滑肌细胞、角质形成细胞（KC）、类软骨细胞的差异表达基因（DEG）进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析，探索细胞功能。 结果:伤后4 d，2组小鼠创面组织中CD34 +细胞均包含7种细胞类型，具体为内皮细胞、Fb、KC、巨噬细胞、T细胞、平滑肌细胞和类软骨细胞，其中Fb细分为5个亚群。与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中的CD34 +内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群4、KC、类软骨细胞占比升高，CD34 +Fb亚群2、Fb亚群3和平滑肌细胞占比下降。注释CD34 +类软骨细胞、内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群2、Fb亚群3、Fb亚群4、Fb亚群5、KC、巨噬细胞、平滑肌细胞、T细胞的标记基因分别为转移相关肺腺癌转录本1、脂肪酸结合蛋白4、Gremlin 1、补体成分4B、H19印记母源表达转录本、Dickkopf Wnt信号通路抑制剂2、纤维调节蛋白、角蛋白5、CD74分子、G蛋白信号调节蛋白5、可诱导T细胞共刺激分子。KEGG和GO富集分析显示，与对照组比较，糖尿病组小鼠伤后4 d创面组织中CD34 +Fb差异表达显著的DEG显著富集于炎症反应、细胞外基质（ECM）组装、细胞增殖调控、衰老相关条目（ P值均<0.05），CD34 +平滑肌细胞差异表达显著的DEG显著富集于细胞迁移、凋亡过程、转录的正调控、吞噬体等条目（ P值均<0.05），CD34 +KC差异表达显著的DEG显著富集于线粒体功能、转录、神经退行性疾病相关条目（ P值均<0.05），CD34 +类软骨细胞差异表达显著的DEG显著富集于节律调控、ECM、病毒感染等相关条目（ P值均<0.05）。 结论:CD34 +细胞在普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合过程中均存在高异质性，2种小鼠创面间CD34 +细胞亚群差异表达显著的DEG显著富集的相关功能与创面愈合过程紧密相关。

目的:富集裸鼠乳腺癌移植瘤中的乳腺癌干细胞并进行分选。方法:将人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于20只裸鼠右侧腋窝皮下，观察肿瘤的生长情况，30 d后剥离肿瘤，对组织进行HE染色，并从组织中分离出肿瘤细胞。用含血清的DMEM培养液培养分离出的移植瘤细胞，观察移植瘤细胞的形态及生长情况；应用流式细胞分选仪检测移植瘤细胞中干细胞（CD44 + CD24 -/low细胞）比例。用含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27细胞培养添加剂的无血清DMEM培养液培养移植瘤细胞，获得细胞微球体；应用流式细胞分选仪检测培养第10天微球体中干细胞比例，并根据细胞表面标志分选出干细胞。 结果:20只裸鼠皮下注入MDA-MB-231细胞9 d后，17只皮下出现肿瘤，肿瘤组织实质细胞多，间质少，瘤细胞呈条索样排列，细胞体积大，胞质丰富，细胞核大小不一，深染，核分裂象多见，核仁清晰，多形性明显。用含血清的DEME培养液培养移植瘤细胞24 h后，细胞开始贴壁，3 d后贴壁率达60%，7 d后细胞增殖加快，细胞形态更趋于一致，多呈梭形，和MDA-MB-231细胞形态无明显差异，其中干细胞比例为（0.10±0.02）%。用含细胞培养添加剂的无血清培养液培养移植瘤细胞后，细胞呈球样生长，第10天微球体中干细胞比例为（70.47±2.03）%。结论:裸鼠皮下接种MDA-MB-231细胞能建立裸鼠乳腺癌异位移植瘤模型，分离出的移植瘤细胞经无血清培养能富集移植瘤中的乳腺癌干细胞，从而能分选出更多乳腺癌干细胞，为研究乳腺癌干细胞生物学特性提供基础。

微流控芯片以高捕获、高回收、微流可控、易于集成化等特点，在循环肿瘤细胞研究中备受关注。微流控体系分选富集循环肿瘤细胞根据捕获原理主要包括依赖生物亲和标签微流控芯片、依赖物理特性免标签微流控芯片和依赖生物亲和与物理特性集成化法微流控芯片法等。

肝癌干细胞(LCSCs)定义为存在肝癌组织中一小部分具有自我更新能力和异质分化潜能的细胞。随着对肝癌发生机制研究的深入，肝癌干细胞驱动理论作为致癌机制之一被提出，而肝癌干细胞的研究重中之重就是如何分选及培养。目前，肝癌干细胞的分选主要基于与非肝癌干细胞的免疫表型和功能特性的差异：利用细胞表达生物标志物分选的方法有荧光激活细胞分选法(FACS)、免疫磁珠分选法(MACS)、激光捕获显微镜切割技术(LCM)等；基于功能特性分选的方法有边缘群细胞分选法、密度梯度离心富集法、无血清培养肿瘤球形成法、荧光标记保留法等，以及待进一步研究的更有利于肿瘤干细胞分选的微流控技术及三维细胞培养体系。本文将对近年来肝癌干细胞的分选方法做一个综述，探讨未来肝癌干细胞分选的研究趋势。

目的:探讨肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表达对常规1型树突状细胞（conventional type 1 dendritic cell，cDC1）的瘤内富集及免疫应答功能的影响。方法:采用免疫荧光染色检测2016年1月至2017年6月北京大学人民医院行肝切除术的111例HCC患者肿瘤组织中cDC1瘤内富集及COX-2表达水平，将HCC患者分为cDC1浸润型与cDC1缺失型，分析HCC细胞表达COX-2与cDC1瘤内浸润的相关性。利用HCC单细胞转录组测序数据检验COX-2编码基因 PTGS2与cDC1亚群比例的相关性。回顾性分析HCC肿瘤组织中cDC1浸润情况与患者临床特征及预后的相关性。通过体外造血干细胞（HSC）向cDC1诱导分化及流式分选，获得HSC来源cDC1，与HCC细胞系共培养后进行转录组测序，并用COX-2选择性抑制剂塞来昔布抑制HCC细胞系的COX-2表达，通过FITC-葡聚糖摄取实验、流式检测、Luminex多因子检测探索HCC中COX-2表达对cDC1的抗原摄取、共刺激分子表达和细胞因子分泌功能的影响。 结果:免疫荧光染色提示cDC1缺失型（ n=73）的HCC肿瘤组织中COX-2表达水平显著高于cDC1浸润型（ n=38）（ P=0.004 2）。单细胞转录组测序数据分析提示 PTGS2高表达的HCC肿瘤组织中cDC1亚群比例显著降低。cDC1浸润型的HCC患者总体生存率（ P=0.037）、无瘤生存率（ P=0.048）优于cDC1缺失型。cDC1与HCC共培养后抗原摄取功能、共刺激分子表达、细胞因子分泌的免疫应答功能受到抑制，塞来昔布可改善cDC1的免疫应答功能。 结论:HCC中cDC1瘤内富集与患者预后良好相关。HCC中表达COX-2可能抑制cDC1向瘤内浸润，抑制cDC1抗原摄取、共刺激分子表达及细胞因子分泌的免疫应答功能。靶向COX-2的抑制剂可逆转HCC对cDC1的功能抑制。

目的:基于转录组测序（RNA-Seq）技术探讨猪苓多糖改变人原代巨噬细胞生长形态的可能分子机制。方法:通过提取粗多糖并进行分离和纯化得到猪苓多糖。Ficoll法分离新生儿脐带血来源的外周血单个核细胞（PBMC），并通过CD14磁珠分选及重组人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导人巨噬细胞，连续5 d观察100 ng/ml猪苓多糖对其生长形态的影响。实验组取巨噬细胞使用猪苓多糖干预48 h，对照组不进行处理，对两组细胞进行转录组测序筛选差异基因；将得到的测序结果进行差异基因表达的GO、KEGG功能注释及信号通路显著性富集分析。结果:诱导巨噬细胞具有贴壁生长及伪足分化能力，贴壁后细胞呈梭形和多角形，伪足较细长。100 ng/ml猪苓多糖处理能显著影响巨噬细胞的生长状态，巨噬细胞伪足逐渐消失且细胞变圆，最终分化褪失。比较两组测序结果发现差异表达基因共13 825个，其中上调基因7028个，下调基因6797个。差异基因的GO功能显著性富集分析显示，差异基因主要集中在细胞外基质（ECM）过程。差异基因的信号通路显著性富集分析结果主要集中在ECM合成与细胞黏附通路。结论:通过RNA-Seq技术证实猪苓多糖影响巨噬细胞的生长状态的分子机制依赖于ECM相关基因及黏附蛋白合成相关基因实现，为进一步研究猪苓多糖对巨噬细胞自身生理功能的调节作用提供依据。

目的 探讨心脏移植物中树突状细胞(DC)和B细胞的抗原提呈特性.方法 将BALB/c小鼠的心脏移植到C57BL/6J小鼠腹腔内,术后5 d(急性排斥反应早期)提取并流式分选心脏移植物中的CD45+细胞,进行单细胞RNA测序.以心脏移植物中的DC和B细胞的亚群为主要对象,通过生物信息学分析和流式细胞术,研究其在心脏移植后变化趋势、抗原提呈能力及其与T细胞之间的胞间通讯情况.采用基因本体(GO)功能富集差异分析佐证细胞亚群特异性功能和细胞亚群注释可信度.结果 生发中心样B细胞(GC-L B)是急性排斥反应期心脏移植物中增幅最大、比例高达87％的B细胞亚群,经典DC(cDC)2是心脏移植急性排斥期间唯一大量增多的DC亚群,占44％,是心脏移植后与T细胞的胞间通讯中占据最高通讯强度的DC亚群;单核样DC(moDC)与记忆性B细胞(MBC)是未心脏移植中T细胞输入信号的主要发出者,而在心脏移植后急性排斥反应期中,转变为cDC2与GC-LB;其中MBC与GC-L B分别是心脏移植前后的主要T细胞输入信号来源.结论 在未移植心脏和移植心脏指向T细胞的胞间通讯中,与DC相比,B细胞均占据更高的通讯数量和权重,推测在心脏移植急性排斥反应早期,B细胞的抗原提呈活动比DC更加活跃,强度更大.

目的:探讨M?bius综合征(MBS)患者的临床特征及可能的遗传发病机制。方法:收集2013年3月至2024年4月首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心的14例(28只眼)散发MBS患者的病例资料。其中，男性5例(10只眼)，女性9例(18只眼)；年龄1 ～ 9岁，平均年龄(4.0±0.7)岁。询问或检查并记录患者的性别、年龄、最佳矫正视力、眼球运动、眼前节和眼底、体格发育及颅神经眼眶磁共振成像(MRI)的情况。采集患者及核心家系成员外周静脉血、提取基因组脱氧核糖核酸(DNA)并在illumina平台行全外显子组测序。使用SAMtools和ANNOVAR软件对变异进行识别和注释，对频率数据库中频率低于1%的变异进行过滤。在此基础上，筛选新生突变基因以及≥2个以上患者共有的突变基因。使用R包的maftools和GenVisR软件包分别行共有基因突变特征分析并绘制景观图。年龄、最小分辨角对数(logMAR)视力以及每个样本携带的共有基因突变数量经Shapiro－Wilk检验符合正态分布，以±s表示。性别、单侧或双侧受累、全身发育异常、突变分类、突变类型、突变频谱及共有基因突变频率采用频数和百分比描述。使用R语言ClusterProfiler中的超几何检验进行基因本体(GO)富集分析，使用Benjamini－Hochberg方法进行多重假设检验校正并筛选显著富集的条目。结果:本研究9例(18只眼)患者的logMAR视力为0.56±0.12。双眼外转受限者有10例(20只眼)，占71.43%(10/14)；单眼外转受限者有4例(4只眼)，占28.57%(4/14)。双侧面瘫者有5例，占35.7%(5/14)；单侧面瘫者有9例，占64.3%(9/14)。伴其他全身发育异常的患者有9例，占64.29%(9/14)。双侧外展神经(CN6)发育不良者有11例，占78.57%(11/14)；单侧CN6发育不良者有3例，占21.43%(3/14)。双侧面神经(CN7)发育不良者有9例，占64.3%(9/14)，单侧CN7发育不良者有5例，占35.71%(5/14)。2例MBS患者发现致病候选基因丛状蛋白D1(PLXND1)新变异2个，分别为杂合错义变异c.C4207T、p.R1403W和剪切位点变异c.2937＋6 G>T。14例患者共筛选出新生突变基因8个，分别为肌联蛋白(TTN)、碳酸酐酶9(CA9)、中间丝相关蛋白(RPTN)、SET结合因子2(SBF2)、丝状肌动蛋白结合蛋白(AFDN)、突触囊泡糖蛋白2C(SV2C)、神经丝蛋白重链(NEFH)和膜金属内肽酶样蛋白1(MMEL1)。≥2个以上患者共有的突变基因总计796个，突变数量为1987个。最常见的突变分类是错义突变，数量为1382个，占69.55%；最多见的突变类型是单碱基替换变异，数量为1534个，占77.20%；最常见的突变频谱是胞嘧啶被替换为胸腺嘧啶，数量为804个，占52.41%。每个样本所携带共有基因突变数量为126～161个，平均(141.93±11.35)个。按照突变频率排名，前10位的共有基因分别为B黑色素瘤抗原家族成员2/3/4/5(BAGE2/3/4/5)、与内体分选复合物Ⅲ相关的钠耐受增加1(IST1)、TTN、高尔基体蛋白A6家族样蛋白2(GOLGA6L2)、NEFH、UBX结构域蛋白11(UBXN11)、二氢硫辛胺支链转酰基酶E2 (DBT)、羰基还原酶4(CBR4)、肌动蛋白相关蛋白3C(ACTR3C)和含V－Set免疫球蛋白域蛋白2(VSIG2)，频率分别为100%、93%、64%、64%、57%、50%、50%、50%、50%和43%。经GO数据库中的生物学过程数据库注释，在本研究全部MBS患者14例(28只眼)中发现的共有突变基因集的基因数量为701个，查询GO数据库获得背景基因集的基因数量为18 722个。比较不同通路的注释基因在此两个基因集中分布的差异，将其概率值按照升序排列，显著富集的通路依次为调控小谷氨酰胺转肽酶介导的信号转导、基于微管的运动、轴突发生、眼形态发生、通过质－膜粘附分子的细胞间粘附、肌动球蛋白结构组装、肌原纤维的组装及微管束的合成，其概率值依次为0.0002、0.004、0.004、0.004、0.004、0.004、0.011及0.011。结论:MBS患者的临床表型异质性较强，多数患者伴随有除面瘫和眼球外转受限以外的多发先天畸形。基于全外显子组测序的生物信息学分析结果提示参与神经发育和轴突生长过程的多个基因和生物学过程可能与MBS发病相关，进一步揭示了遗传因素在MBS发病中的作用。