目的 通过网络药理学初步探究大黄致肝毒性潜在作用机制,并结合细胞实验进行验证.方法 基于网络药理学,通过多种数据库进行成分收集、靶点预测;结合软件进行PPI网络构建、GO富集分析和KEGG通路分析,系统性预测大黄致肝毒性作用机制;通过原代肝细胞实验以及Western blot实验对网络药理学预测出的通路信息进行验证.结果 网络药理学结果表明,大黄酸(Rhein,RH)为大黄致肝毒性主要成分;得到大黄致肝毒性核心靶点17个;KEGG结果提示DNA损伤以及细胞凋亡是大黄致肝毒性的关键机制之一.原代肝细胞实验以及Western blot实验结果表明,RH能够抑制小鼠原代肝细胞活性,呈时间-剂量依赖性;P450酶广谱抑制剂1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole,ABT)和CYP2C9抑制剂磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole,SFP)能够显著降低RH对小鼠原代肝细胞的毒性,CYP2C9诱导剂利福平(Rifampicin,RFP)能够增加RH对小鼠原代肝细胞的毒性;经不同浓度RH处理后,小鼠原代肝细胞PARP-1、γ-H2AX蛋白上调.结论 大黄中RH能够显著抑制小鼠原代肝细胞活力,其对小鼠原代肝细胞的毒性可能是CYP2C9对RH代谢活化所致;RH可激活PARP-1,使H2AX磷酸化,诱导小鼠原代肝细胞DNA损伤,从而导致细胞凋亡.

目的 探究普托马尼(PA-824)对利福平(RFP)依赖结核菌感染小鼠的作用及其机制研究.方法 将32只SD雄性小鼠随机分为RFP治疗组、PA-824治疗组、联合治疗组和对照组,每组8只.所有小鼠以结核分枝杆菌RFP依赖株攻毒,复制RFP依赖结核病小鼠模型,RFP治疗组给予65 mg/(kg·d)RFP,PA-824治疗组给予25 mg/(kg·d)PA-824,联合治疗组给予上述2种药物,对照组予以等量生理盐水灌胃.治疗6周后观察小鼠脾、肺组织重量,脏器致病指数,脾、肺组织荷菌量及肺组织病理学变化.结果 与对照组比较,RFP治疗组的肺重量、脾重量、脾菌量、肺菌量均升高(P<0.05),PA-824治疗组和联合治疗组的肺重量、脾重量、脏器致病指数评分、脾菌量、肺菌量均降低(P<0.05);与联合治疗组比较,RFP治疗组和PA-824治疗组的肺重量、脾重量、脏器致病指数评分、脾菌量、肺菌量均升高(P<0.05);与RFP治疗组比较,PA-824治疗组的肺重量、脾重量、脏器致病指数评分、脾菌量、肺菌量均降低(P<0.05).结论 PA-824在抑制MTB对RFP依赖性的同时,对RFP依赖结核菌感染小鼠具有较好的抑制作用,同时对改善病变范围与病变程度均有一定的效果.

目的:分析利福平依赖性肺结核患者的临床特征,探讨利福平依赖肺结核病产生的原因,为利福平依赖性结核病的诊断和防治提供依据.方法:调查30例利福平依赖肺结核患者的临床资料,分析利福平依赖性肺结核患者的病情及化疗情况,探讨利福平依赖性肺结核病发生原因及防治措施.结果:30例利福平依赖性肺结核患者的临床分析结果显示,复治患者占多数,达93.3%(28/30),初治患者仅占6.7%(2/30);患者以青年组居多,达63.3%(19/30),中年组占30.0%(9/30),老年组占6.7%(2/30);30例依赖利福平病例全部为耐多药结核(MDR-TB)(100%),其中广泛耐药结核(XDR-TB)为5例(16.6%),30例依赖利福平肺结核病例均对利福平耐药,对其他抗结核药物耐药率主要以链霉素和异烟肼、左氧沙星为较高,分别为93.3%、90.0%和43.3%,对其他抗结核药物的依赖率以对异烟肼、链霉素和乙胺丁醇较高,分别为76.2%、63.3%和26.7%.28例复治患者初治不合理或不规则用药的占71.4%(20/28),使用利福平治疗次数超过3次者可达58.3%,化疗效果较差.结论:依赖利福平肺结核患者以青年人居多,耐多药率高、病情较重为主要临床特征,肺结核患者长期不合理或不规则用药是产生药物依赖性结核病的主要原因.

目的:在体外培养条件下,研究表观遗传相关的组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)对依赖利福平(R)结核分支杆菌菌株生长的影响.方法:采用匡氏琼脂培养基及技术,分别观察临床分离R依赖株和R耐药株在含R和VPA的培养基中生长情况,探究VPA对结核菌利福平依赖性的影响.结果:利福平依赖株在含R+VPA的培养基上生长较在仅含R培养基上生长落数和旺盛程度均下降;而利福平耐药株在含R+VPA的培养基上生长与在仅含R培养基上生长落数和旺盛程度比较,未见明显差别.结论:VPA在体外可显著抑制结核分支杆菌对利福平的依赖性.

目的:建立基于免疫共沉淀-液质联用技术的新型孕烷X受体(PXR)配体检测方法.方法:在HEK293细胞中转染带有Flag标签的PXR表达载体,裂解细胞后用偶联Flag抗体的微珠(beads)结合并分离细胞中表达的Flag-PXR蛋白;以PXR的已知最为公认的配体/激动剂利福平为模型药物,配制1μmol/L利福平溶液,与结合有Flag-PXR蛋白的微珠孵育形成微珠-蛋白-利福平复合物;将微珠从体系中分离出来,用蛋白印迹实验检测复合物中的蛋白质,用液相色谱-质谱联用技术(液质联用技术)检测复合物中的利福平.在此基础上对利福平的作用进行验证,在肝细胞癌细胞HepG2中检测系列浓度梯度的利福平对PXR转录因子活性的影响.结果:用免疫共沉淀技术从HEK293细胞中分离鉴定得到Flag-PXR蛋白;用液质联用技术检测到蛋白与小分子复合物中的利福平;利福平能够剂量依赖地诱导PXR的转录因子活性.结论:建立了基于免疫共沉淀-液质联用技术的新型PXR配体检测方法.

目的 研究茴三硫对利福平所致药物性肝损伤的保护作用,并初步研究其机制.方法 将♂ SD大鼠随机均分为对照组、模型组、茴三硫低、中、高剂量(5、10、25 mg· kg-)组;观察大鼠肝脏组织的病理切片,测定肝功能生化指标和血清中胆汁酸的水平;采用qPCR实验检测大鼠肝脏组织中多药耐药相关蛋白2(Mrp2) mRNA的表达水平.结果 与模型组比较,茴三硫显著地减少了大鼠肝脏组织中变性或坏死的肝细胞,未见明显肝脏病变;显著地降低了血清中碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、胆汁酸的水平;显著地提高了肝脏组织中Mrp2 mRNA的表达水平,且呈剂量依赖性.结论 茴三硫对利福平所致药物性肝损伤具有保护作用,其保肝、利胆作用的机制可能与上调肝脏组织中Mrp2的表达水平,减少胆汁淤积有关.

目的:探究利福平对附子急性毒性物质的诱导降解效果.方法:建立附子诱导小鼠心律失常模型,通过分析心电图、血清乳酸脱氢酶同工酶l(lactate dehydrogenase isoenzyme,LDHl)活力和心肌组织切片比较不同浓度利福平诱导解毒的效果.结果:不同浓度的利福平溶液可以显著改善附子诱导的心脏损伤,部分逆转心动过速,减少心律失常的发生,降低心肌缺血发生率,抑制血浆心肌酶LDH1活性(P＜0.001),组织病理切片结果提示利福平可以减轻口服生附片后心肌损伤坏死程度.结论:利福平作为肝药酶诱导剂可以显著减轻附子的急性毒性,该作用呈剂量依赖性.

目的 探究孕烷X受体(PXR)对HepG2细胞程序性细胞死亡因子(PDCDs)的调控作用及其分子机制.方法 HepG2细胞给予不同的PXR激动剂刺激24h,分为利福平(10 μmol/L)组、SR12813(1 μmol/L)组和DMSO对照组;采用持续激活型PXR的腺病毒感染HepG2细胞(VP-PXR组和Mock对照组)36 h.应用qRT-PCR技术检测PDCD2、PDCD4、PDCD5、PDCD6基因以及miRNA21的表达变化,采用Western blot技术检测PDCD4的蛋白表达水平.运用生物信息学方法预测PDCD4启动子区存在的潜在PXR结合反应元件(PXREs).结果 qRT-PCR结果显示利福平与对照组相比,PDCD2的表达显著下调(t=-2.875,P＜0.05),PDCD4表达则显著上调(t=4.209,P＜0.01),而PDCD5和PDCD6无明显差异.SR12813与对照组相比,PDCD4表达明显升高(t=4.574,P＜0.01),PDCD2、PDCD5和PDCD6均无明显变化.同时,利福平、SR12813组与对照组相比,PXR经典靶基因MDR1的表达显著升高(P＜0.05);VP-PXR与Mock对照组相比,PDCD2和PDCD6的基因表达无明显差异,PDCD4基因的表达则显著上调(t=3.343,P＜0.05),MDR1的表达也显著升高(t=3.343,P＜0.01);给予利福平刺激后,PDCD4的蛋白表达比对照组显著升高(t=2.779,P＜0.05);PDCD4的蛋白在VP-PXR组也显著高于Mock组(t=3.066,P＜0.05);机制研究发现利福平或VP-PXR腺病毒刺激细胞后与各自对照组相比,PDCD4上游负调控因子miRNA21表达均无明显差异.利用生物信息学软件分析后发现,PDCD4启动子区存在PXREs.结论 PXR活化上调HepG2细胞内PDCD4的表达,但不依赖于miRNA21,PDCD4在HepG2细胞可能是PXR的靶基因.

耐药结核病的流行使当前结核病的控制工作面临着严峻的挑战.研究发现,结核病初治耐药的形成一方面与结核分枝杆菌的基因变异有关,另一方面是健康人被复治的耐药患者携带的结核分枝杆菌传染所致,而复治耐药结核病患者的出现则与用药史有很大关系[1].利福平通过与由 rpoB 基因编码的 RNA聚合酶亚基特异性结合,阻断结核分枝杆菌 RNA 的合成,导致结核分枝杆菌的死亡[2],从而达到治疗目的.rpoB基因在结核分枝杆菌基因组中只有 1 个拷贝,它含有3534 bp 的开放读码框,当 507～533 位27个氨基酸密码子的 81 个碱基的 RRDR 区发生突变(包括点突变或短的插入、缺失突变等)时,使DNA依赖的 RNA 聚合酶活性下降,利福平与 RNA 聚合酶亚单位结合力减弱,从而发生细菌对利福平的耐药[3].有关研究报道,95％或更高比例的利福平耐药株的rpoB基因突变位于此区域[4].贵阳市公共卫生救治中心于2019 年1 月26 日收治1 例肺结核复治病例,痰液核酸检测结果为结核分枝杆菌阳性,然后进行耐药基因芯片扫描检测 rpoB 基因,显示为 511 位点信号值极低、513 位点和 516 位点无信号值,高度怀疑为缺失,异烟肼结果敏感.为进一步明确 rpoB 基因是否存在多个位点缺失,本研究进行第一代基因测序,现就该患者出现的 rpoB 基因多位点缺失及治疗欠佳的原因进行分析.

目的:探讨2种一线[利福平(RFP)和异烟肼(INH)]和2种二线[阿米卡星(AMK)和对氨基水杨酸(PAS)]抗结核药物对肺泡上皮细胞Toll样受体(TLRs)信号通路信号分子和炎症因子表达的影响.方法:分别采用不同剂量RFP、INH、AMK和PAS作用于A549细胞,qRT-PCR、Western blot和ELISA在核酸和蛋白水平分析TLRs信号通路相关信号分子和炎症因子表达变化.结果:当在细胞培养液中加入10.54 μg/ml RFP时,可抑制A549细胞TLRs受体信号通路,降低IL-12表达;当添加5.00 μg/ml INH时,可促进NFκB表达及IL-8与IL-12分泌,但TLR2和MyD88表达被抑制;AMK可激活A549细胞TLRs信号通路,并通过其他途径抑制炎症因子IL-8和IL-12表达;PAS可激活A549细胞TLRs信号通路,并促进IL-8、IL-12表达及分泌.结论:RFP和AMK分别抑制和促进TLRs信号通路活化,并抑制炎症因子分泌;INH可激活MyD88非依赖性通路,PAS可活化TLRs信号通路,进而促进炎症因子分泌,为抗结核药物的临床应用提供参考.