目的:研究海盐弗朗西斯菌( Francisella salimarina)的系统发育和毒力基因分布情况。 方法:纳入GenBank数据库中的相关基因组数据，对海盐弗朗西斯菌及邻近菌种进行系统发育分析，分析16S rRNA基因、 rpoB基因、 mdh基因等单个基因与核心基因组系统发育的一致性，基于毒力因子数据库和抗生素耐药基因数据库注释并分析毒力基因及耐药基因。以蜃楼弗朗西斯菌( Francisella philomiragia) ATCC 25015 T为参考，采用大蜡螟幼虫感染试验评估海盐弗朗西斯菌的毒力。 结果:海盐弗朗西斯菌在系统发育上与蜃楼弗朗西斯菌亲缘关系最为相近。系统发育树比较发现， mdh基因系统发育树与核心基因组系统发育树高度相似。而单基因系统发育分析显示，基于16S rRNA基因和 mdh基因序列分析均能鉴别海盐弗朗西斯菌及邻近菌种，但 mdh基因具有更强的区分能力。8株海盐弗朗西斯菌共检出多种毒力基因，主要与分泌系统、黏附、免疫调节、运动和应激生存相关。此外，8株菌均检测到β-内酰胺类耐药基因 blaFPH。该菌在大蜡螟幼虫感染试验中表现出较高的致死能力，与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015 T相近。 结论:海盐弗朗西斯菌是一种致病能力与蜃楼弗朗西斯菌相近的罕见病原体， mdh基因可作为快速鉴定海盐弗朗西斯菌的分子靶标。

本研究旨在构建基于核酸滚环扩增（RCA）的简便快速、超灵敏的光学生物传感技术，并将其运用于结核杆菌耐药相关基因的多重检测。本研究在2020年2月至2021年5月期间，于陆军军医大学第一附属医院检验科，针对异烟肼、利福平和链霉素耐药的高频基因突变位点katG315（AGC?ACC）、rpoB531（CAC?TAC）和rpsL43（AAG?AGG），分别设计锁式探针（padlock probe，PLP）、引物和捕获探针，构建了基于磁珠的固相RCA恒温扩增反应体系，并进行了实验参数的优化。通过多色荧光探针（Cy3/Cy5/ROX）对RCA产物精准捕获与信号放大，实现了对3种突变基因的单管多重检测。进一步对该方法的灵敏度、特异性与线性范围等分析性能进行验证，结果显示同一反应体系中katG315的响应范围为1.0 pmol/L至0.1 nmol/L，rpoB531和rpsL43的响应范围为1.0 pmol/L至50.0 pmol/L和1.0 pmol/L至20.0 pmol/L，且该方法具有较好的特异度与灵敏度，在混合靶标中可精确识别单碱基突变，最低检出限低至1.0 pmol/L；在模拟血清样本的回收实验中，回收率可达95.0%~105.2%。综上，本研究构建的恒温扩增型多重检测方法可快速实现3种耐药突变位点的单管多重检测，该技术成本低廉、简便快速、不依赖大型设备，为病原体耐药基因检测提供了一种新的分析方法。

目的:利用全基因组测序数据分析中国耐多药结核分枝杆菌的耐药相关基因突变谱及主要突变类型与菌株基因型的相关性。方法:查询并下载NCBI数据库中截至2019年8月公开发表的中国结核分枝杆菌全基因组测序数据，利用全基因组数据预测菌株分子药敏结果，统计不同药物耐药相关基因的突变类型，并分析耐药突变类型与菌株基因型的相关性。结果:根据分子药敏结果从2 019株菌株中鉴定出1 024株耐多药菌株，对常用抗结核药物的耐药相关基因主要突变类型分别为 katG S315T（73.2%，异烟肼）、 rpoB S450L（63.1%，利福平）、 rpsL K43R（70.0%，链霉素）、 embB M306V（37.4%，乙胺丁醇）、 pncA启动子区T（-11）C（7.9%，吡嗪酰胺）、 gyrA A90V （32.3%，氟喹诺酮类）、 rrs A1401G（67.7%，二线注射类）、 fabG1启动子区C（-15）T（87.0%，乙硫异烟胺）、 folC I43T（30.4%，对氨基水杨酸）。其中， katG S315T、 rpsL K43R、 embB M306V、 gyrA D94G在L2系菌株中的频率显著高于L4系菌株， folC I43T仅在L2系菌株中发现； katG S315T在古典北京型菌株中比例较高，而 rpsL K43R在现代北京基因型菌株中的比例更高，其差异均有统计学意义（均 P<0.05）。 结论:本研究提供了基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌对多种常用抗结核药的耐药相关基因主要突变类型，为研发敏感、特异的快速分子检测方法提供了依据；同时也发现多种耐药相关基因主要突变类型与菌株基因型有关。

目的:建立纹带棒状杆菌的多位点序列分型（MLST）方法，探讨临床分离纹带棒状杆菌的种群结构和遗传进化关系。方法:筛选出7个管家基因（ gyrA、 gyrB、 hsp65、 sodA、 secA1、 rpoB、16S rRNA），设计引物并进行PCR扩增和测序，测序所得序列通过SeqMan 软件进行拼接。采用DnaSP 5.10.01软件、Splits tree 4.14.2软件对管家基因的多样性及基因重组特征进行评价；采用MEGA 7.0.14软件基于序列型别（ST）采用M-L法构建系统发育树，采用BioNumerics软件基于ST特征值构建最小生成树，并用eBURST软件分析ST间遗传进化关系。 结果:所选的7个位点在所有试验菌株中均获得了预期的扩增产物；Splits tree表明所有纹带棒状杆菌的聚类一致，提示基因重组是推动纹带棒状杆菌进化的潜在动力；MLST将344株纹带棒状杆菌分成72个STs，85.7%的菌株形成克隆复合体（CC）结构，CC19形成了优势克隆复合体，但包含菌株数最多的ST为该克隆复合体中的ST16。ST具有一定的地域聚集性且与分离年份具有一定的相关性。结论:我国纹带棒状杆菌呈现高度的遗传多样性，CC19为优势克隆复合体。本研究建立的MLST分型方案可用于纹带棒状杆菌的分型，但尚需优化改进。

目的:比较二代测序（NGS）检测方法在痰标本和结核分枝杆菌菌株中耐药性的诊断效能，从而探讨NGS方法检测痰标本耐药性的可行性。方法:本研究属于回顾性研究，收集了北京胸科医院2017年1—12月收治50例肺结核患者的痰标本和相应的临床分离菌株。用NGS方法分别检测痰标本和相应的临床分离菌株 katG、 inhA、 rpoB、 embA、 embB、 rpsL、 rrs、 gyrA、 gyrB、 tlyA的基因突变。采用比例法对菌株进行表型药敏试验（drug susceptibility test，DST）。以DST结果为参考，分别计算临床菌株NGS方法、痰标本NGS方法敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及与表型DST的一致性统计量（ Kappa）。对于NGS检测在痰标本和菌株样本中的准确性比较用 χ2检验。 结果:在各种突变基因中， rpoB（63.83%，30/47）与 rrs（57.45%，27/47）最常见，其次是 katG（46.81%，22/47）、 rpsL（29.79%，14/47）、 gyrA（27.66%，13/47）、 embB（21.28%，10/47）、 tlyA（12.77%，6/47）、 gyrB（8.51%，4/47），以及 inhA启动子区（19.15%，9/47）、 embA启动子区（12.77%，6/47）突变。NGS方法与异烟肼、利福平、乙胺丁醇、二线注射类药物（链霉素、卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星）、左氧氟沙星的耐药表型相比，在痰样本中，敏感度分别为85.71%、91.67%、77.78%、81.82%、100.00%、87.50%、100.00%、69.23%，特异度分别为100.00%、94.12%、87.50%、89.47%、97.06%、96.97%、94.29%、89.29%。在菌株样本中，敏感度分别为92.86%、100.00%、81.82%、86.96%、88.89%、80.00%、100.00%、85.71%，特异度分别为100.00%、92.86%、87.10%、94.74%、100.00%、100.00%、97.14%、92.86%。与表型药敏结果相比，在痰标本中，NGS方法对异烟肼、利福平、卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星具有较好的检测效能（ Kappa值≥0.75）；在菌株中，NGS方法对异烟肼、利福平、链霉素、卷曲霉素、卡那霉素，阿米卡星及左氧氟沙星具有较好的检测效能（ Kappa值≥0.75）。以NGS方法检测菌株的准确度为参照，检测的所有药物耐药情况在菌株和痰标本中的准确性差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:本研究表明通过NGS技术检测痰标本及菌株基因型来预测异烟肼、利福平及二线注射类药物（卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星）耐药均具有较好的效能，提示NGS方法直接检测痰标本作为早期耐药检测方法的可行性及潜力。

目的:研究1株不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制。方法:回顾性研究，2016年7月临床分离的1株耐碳青霉烯类不动杆菌属，用Vitek2-compact分析仪进行细菌鉴定和药敏试验，并分别检测bla OXA-51-like基因、16S-23S rRNA基因间隔区序列和RNA聚合酶亚基基因（rpoB），以确定菌株型别。PCR扩增检测碳青霉烯酶基因（NDM、KPC、VIM、IMP、SIM、SPM、GIM、OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-58-like）、16S rRNA甲基化酶（armA、rmtA、rmtB)、β内酰胺酶（TEM、SHV、CTX-M、VEB、PER）以及一类整合子；另用Southern杂交方法检测耐药菌株质粒情况。 结果:通过基因分析，证实此菌为 Acinetobacter baylyi，并且仅携带NDM-1型碳青霉烯酶，其他相关耐药基因均为阴性结果。质粒分析发现bla NDM-1位于约54 000~60 000 bp不可接合质粒上。 结论:应注重耐碳青霉烯类非鲍曼不动杆菌的出现及其耐药基因的传播机制。

目的:利用全基因组测序技术分析上海地区莫西沙星和氧氟沙星同时耐药的结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis, Mtb)分子特征，为 Mtb感染患者的临床诊疗提供科学依据。 方法:收集同济大学附属上海市肺科医院保存的142株莫西沙星和氧氟沙星同时耐药的 Mtb临床分离株。使用Sensititre ? MYCOTB plate进行微孔板法药敏试验；Illumina平台对142株 Mtb进行测序；TB-Profiler确定其谱系和耐药相关基因的突变位点；Snippy进行细菌核心基因组系统发育分析。 结果:表型药敏结果显示142株莫西沙星和氧氟沙星耐药的 Mtb分离株对异烟肼和利福平的耐药率分别为33.80%(48/142)和22.54%(32/142)；76.06%(108/142)的分离株检测到14种氟喹诺酮耐药基因相关突变，其中以 gyrA基因Asp94Gly(21.83%，31/142)、Ala90Val(15.49%，22/142)和Asp94Tyr(9.15%，13/142)突变为主。异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、乙硫异烟胺和卡那霉素的常见耐药突变类型分别为 katG Ser513Thr(68.75%，33/48)、 rpoB Ser450Leu(53.13%，17/32)、 embB Met306Val(44.44%，8/18)、 rpsL Lys43Arg(77.50%，31/40)、 rrs 1401A→G(100.00%)、 fabG1 -15C→T(50.00%，4/8)、 rrs 1401A→G(100.00%)。142株 Mtb分为2个谱系，分别为L2谱系(92.25%, 131/142)和L4谱系(7.75%, 11/142)；其中L2谱系以L2.2.1亚型(80.28%，114/142)为主，L4谱系以L4.5亚型(5.63%，8/142)为主。系统发育分析和单核苷酸多态性分析显示多株L2谱系菌株可能存在流行病学联系。 结论:本地区莫西沙星和氧氟沙星耐药的 Mtb主要流行基因型为L2型，应加强耐药结核病的防控工作。

目的:分析布鲁氏菌利福平耐药株rpoB基因的突变特征。方法:选取分离自新疆维吾尔自治区的4株布鲁氏菌利福平耐药株（JSY-26、G-9、WSY-13、AW-3株）DNA，采用PCR扩增利福平rpoB基因，并对核苷酸序列进行测序。以布鲁氏菌利福平耐药标准株（RB51株）和利福平敏感株（ALT-8株）的rpoB基因序列为参照，应用Mega 7.0软件比对分析4株布鲁氏菌利福平耐药株rpoB基因利福平耐药决定区（rifampicin resistance determination region，RRDR）内外的碱基突变位点及类型。结果:经序列比对分析，JSY-26和WSY-13株均在rpoB基因RRDR 1 576 bp处发生单碱基点突变，碱基由鸟嘌呤（guanine，G）突变为腺嘌呤（adenine，A）；G-9株在rpoB基因RRDR 1 606 bp处发生单碱基点突变，碱基由胞嘧啶（cytosine，C）突变为A。AW-3株在rpoB基因RRDR外2 536、2 537、2 626、2 636、2 654 bp处出现3种类型共5处突变，分别为插入突变3处[胸腺嘧啶（thymine，T）插入1次、C插入2次]，缺失突变1处（C缺失），单碱基点突变1处（由G突变为C）。结论:布鲁氏菌利福平耐药株rpoB基因RRDR突变以单碱基点突变为主，RRDR外则出现多位点插入和缺失突变。

结核分枝杆菌是世界范围内导致死亡人数最多的病原体，抗结核药物耐药性的出现对公共卫生构成了日益严重的威胁。耐多药结核病的全球负担最近以每年20%以上的速度增长。根据世界卫生组织的资料，在接受治疗的所有耐多药结核病患者中，大约只有50%的患者治愈，针对耐多药结核病的研究迫在眉睫。与其他抗结核药物相比，结核分枝杆菌对利福平的耐药机制最为明确，主要是由 rpoB基因相关位点突变引起。这为开发快速检测方法提供了便利条件，也为研究结核分枝杆菌的一般耐药机制提供了理想的研究对象。现就影响结核分枝杆菌对利福平耐药的机制进行综述。

目的:了解艾滋病合并结核感染的临床表现及病原学诊断特征，探讨提高HIV/AIDS患者合并结核感染诊断率的方法。方法:选取2012年10月至2019年12月在湘西自治州人民医院确诊HIV/AIDS合并结核病的116例患者为观察组，另选取同期单纯性结核病初治患者59例为对照组。收集两组患者的临床症状、肺外结核、肺结核影像学特点、PPD结核菌素反应、样本夹层杯法抗酸染色结果、结核感染T细胞免疫斑点检测（T-SPOT.TB）结果、结核分支杆菌 rpoB基因检测（XPERT）结果，并进行两组间比较。分析不同CD4 + T细胞计数的观察组PPD和呼吸道样本（痰及灌洗液）夹层杯法抗酸染色的阳性率情况。 结果:观察组主要临床表现为反复中高热（82.76%）和体重下降（75.00%），肺外结核的发生率（56.89%）明显高于对照组（ χ2= 10.911， P<0.05）。观察组的肺内病灶多侵犯2个甚至≥3个肺野（30.17%和46.55%），粟粒样改变多见（21.55%），均显著高于对照组（ χ2=7.160、7.310和4.709， P均<0.05）。观察组的常规PPD试验、呼吸道样本夹层杯抗酸染色检查以及初始T-SPOT.TB阳性率为14.66%、34.48%和46.67%，均明显低于对照组的40.68%、52.54%和82.35%（ χ2=14.763、5.290和10.471， P均<0.05）；两组复核后的T-SPOT.TB及XPERT检测阳性率均较高，且差异无统计学意义（ χ2=1.857和0.405， P>0.05）；肺外组织/穿刺液样本夹层杯法抗酸染色检查观察组阳性率达100.00%，高于对照组的66.67%（ χ2=12.291， P<0.05）。观察组患者中，CD4 +T细胞计数越低，PPD阳性率和呼吸道样本夹层杯抗酸染色阳性率也越低。 结论:HIV/AIDS合并结核病患者的临床表现不典型，常规免疫学检查阳性率低；痰液和肺外样本的XPERT检测、改良的血液样本T-SPOT-TB检测、肺外组织和穿刺液的样本夹层杯法抗酸染色检查，均有助于艾滋病患者合并结核病的诊断。