目的:分析布鲁氏菌利福平耐药株rpoB基因的突变特征。方法:选取分离自新疆维吾尔自治区的4株布鲁氏菌利福平耐药株（JSY-26、G-9、WSY-13、AW-3株）DNA，采用PCR扩增利福平rpoB基因，并对核苷酸序列进行测序。以布鲁氏菌利福平耐药标准株（RB51株）和利福平敏感株（ALT-8株）的rpoB基因序列为参照，应用Mega 7.0软件比对分析4株布鲁氏菌利福平耐药株rpoB基因利福平耐药决定区（rifampicin resistance determination region，RRDR）内外的碱基突变位点及类型。结果:经序列比对分析，JSY-26和WSY-13株均在rpoB基因RRDR 1 576 bp处发生单碱基点突变，碱基由鸟嘌呤（guanine，G）突变为腺嘌呤（adenine，A）；G-9株在rpoB基因RRDR 1 606 bp处发生单碱基点突变，碱基由胞嘧啶（cytosine，C）突变为A。AW-3株在rpoB基因RRDR外2 536、2 537、2 626、2 636、2 654 bp处出现3种类型共5处突变，分别为插入突变3处[胸腺嘧啶（thymine，T）插入1次、C插入2次]，缺失突变1处（C缺失），单碱基点突变1处（由G突变为C）。结论:布鲁氏菌利福平耐药株rpoB基因RRDR突变以单碱基点突变为主，RRDR外则出现多位点插入和缺失突变。

目的 了解临床分离的纹带棒状杆菌对抗菌药物的敏感性及其感染或定植患者的临床特征.方法 收集福建医科大学附属泉州第一医院2020年7月—2022年9月临床分离纹带棒状杆菌72株,采用肉汤微量稀释法检测细菌对18种抗菌药物的敏感性.PCR扩增检测喹诺酮类耐药决定区相关基因gyrA并进行测序以分析氨基酸突变位点,PCR扩增核糖体甲基化酶基因ermX和氨基糖苷修饰酶基因aphA1并进行测序分析.病史资料分析纹带棒状杆菌感染或定植患者的临床特征.结果 药敏试验结果显示,所有菌株对万古霉素、利奈唑胺和达托霉素均100％敏感,对头孢曲松、环丙沙星及莫西沙星均100％耐药,对青霉素(87.5％)、头孢吡肟(95.8％)、美罗培南(95.8％)、甲氧苄啶-磺胺甲唑(90.3％)、红霉素(98.6％)和克林霉素(98.6％)的耐药率较高,对庆大霉素(25.0％)、四环素(30.6％)和利福平(23.6％)耐药率较低.PCR及DNA测序结果显示,3株纹带棒状杆菌发生gyrA基因单点突变(Ser87Val),67株发生双突变(Ser87Phe、Asp91Ala或Ser87Tyr、Asp91Ala),2株发生三位点突变(Ser87Phe、Ala88Pro和Asp91Ala),其中三位点突变是本研究首次发现的突变模式.所有的纹带棒状杆菌均检出ermX基因,aphA1基因检出率为43.1％.病史资料结果显示,72株纹带棒状杆菌主要分离自ICU(占65.2％),标本来源以下呼吸道标本为主(占91.6％),患者平均年龄(68.0±15.3)岁,感染和定植患者比例分别占72.2％(52/72)和27.8％(20/72),两组患者在住院时长≥28 d、合并脑出血、意识障碍及病情恶化方面差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 该院临床分离的纹带棒状杆菌均为多重耐药菌,感染患者预后相对较差.

目的 阐明Xpert阳性患者利福平耐药决定区(RRDR)突变特征,并探讨Xpert单独或联合检测对结核病的诊断效能.方法 选取2019年12月-2022年3月遂宁市中心医院门诊及住院部收治的疑似结核病患者1 418例为研究对象,1418例患者均送检标本进行Xpert检测,对同时进行抗酸涂片、结核培养、Xpert、结核分枝杆菌DNA(DNA)检测的664例可疑结核病患者根据临床最终诊断将其分为结核病组(n=435)和非结核组(n=229).分析Xpert阳性标本rpoB基因RRDR突变情况及抗酸涂片、结核培养、Xpert、DNA单独或联合检测诊断结核病的灵敏性、特异性、约登指数和受试者工作特征曲线下面积(AUC).结果 1418例患者均送检标本进行Xpert检测,阳性550例,阳性率为38.79％;550例Xpert检测阳性患者中,50例利福平耐药,利福平耐药率为9.09％;rpoB基因RRDR突变以单探针突变为主,单探针突变率最高的为Probe E[60.00％(30/50)],其次为Probe A[16.00％(8/50)]、Probe D[(14.00％(7/50)]、Probe B[6.00％(3/50)],未发现Probe C的突变;检测到2例双探针突变,未发现三探针突变.以临床最终诊断为金标准,Xpert单独检测诊断结核病的灵敏性、特异性、约登指数、AUC分别为82.07％、94.76％、0.77、0.884,高于抗酸涂片、结核培养、DNA单独检测;抗酸涂片+结核培养+Xpert诊断结核病的灵敏性、特异性、约登指数、AUC分别为93.56％、94.76％、0.88、0.942,高于抗酸涂片+结核培养(67.13％、92.58％、0.60、0.799)和抗酸涂片+结核培养+DNA检测(74.48％、91.70％、0.66、0.831),但略低于抗酸涂片+结核培养+Xpert+DNA检测(96.55％、96.94％、0.93、0.967).结论 rpoB基因RRDR突变以Probe E单探针突变为主,未检测到Probe C的突变以及三探针突变.从诊断经济学考虑,抗酸涂片+结核培养+Xpert检测在结核病诊断中具有良好的诊断效能.

目的 分析云南省结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征.方法 应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,,PCR)法对1株H37Rv结核分枝杆菌标准株及102株结核分枝杆菌临床分离株中包含“利福平耐药决定区”在内的rpoB基因片段进行扩增,并将扩增产物进行直接基因测序,测序结果用MEGA 5软件进行分析.结果 利福平耐药基因型与表型的符合率为92.00％ (69/75),突变类型11种,涉及氨基酸11种,均为碱基的点突变,单位点突变占92.96％,联合突变占7.04％,突变率最高的位点依次是rpoB531(43.66％)、rpoB526(26.76％)、rpoB516(9.86％),前3个位点的突变占总突变的80.28％.初复治患者临床分离株rpoB耐药突变位点构成差异无统计学意义(x2=7.653,P=0.354);耐多药结核与单耐利福平临床分离株rpoB突变位点构成差异有统计学意义(x2=16.917,P=0.010).结论 对rpoB的突变的检测在云南省可作为利福平耐药筛查的重要指标.rpoB基因突变可能不受是否使用过利福平和使用时间长短的影响,但是异烟肼可能会影响结核分枝杆菌rpoB基因突变的分子机制.

目的:研究分离自首次复治肺结核病患者的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)临床菌株对利福平的耐药性,及其与rpoB基因利福霉素耐药决定区(rifampicin resistance determining regions,RRDR)位点突变间的相关性.方法:收集2013年2月至2013年12月国内19家医院的首次复治肺结核患者的Mtb,进行利福平药敏检测;使用PCR技术检测Mtb的rpoB基因RRDR位点突变.结果:来自全国12个省19家医院共141例患者的141株临床菌株获得药敏结果,而RRDR位点测序分析显示首次复治结核患者中有53％(75/141)对利福平耐药.RRDRDNA测序共检测到72株Mtb存在rpoB耐药突变区突变,其中71株的突变发生在RRDR,主要突变位点分别为531位(42株)、526位(11株)和516位(10株).有75株Mtb对利福平耐药,其中70株(93.3％)检测到rpoB突变,69株的突变发生在RRDR;除了2株L511P、H526N突变的Mtb对利福平敏感,70株rpoB突变株均对利福平耐药.对于复治结核患者,检测RRDR突变判断利福平耐药有较高的特异度.结论:首次复治肺结核病患者对利福平耐药率较高,Mtb耐利福平与rpoB基因RRDR突变密切相关,RRDR突变检测可以用于快速鉴定复治肺结核病患者的Mtb利福平耐药.

目的 分析结核分枝杆菌利福平耐药的分子药敏(Xpert MTB/RIF)检测与在表型药敏(Bactec MGIT 960)检测结果不一致的机制. 方法 从2015年10月-2018年4月在长沙医学院第一附属医院进行Xpert MTB/RIF检测的8 274位患者中筛选出Xpert MTB/RIF检测利福平耐药而Bactec MGIT 960利福平敏感的患者39例,以及Xpert MTB/RIF检测利福平敏感而Bactec MGIT 960利福平耐药的患者7例,共46例患者标本复苏其分离株,然后提取基因组DNA并进行rpoB的利福平耐药决定区域(rifampicin resistance determining region,RRDR)测序,同时对所有复苏的分离株进行最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)测定,观察不同突变菌株的耐药程度. 结果 46例患者中有2例菌株复活失败、2例菌株丢失,剩下42例菌株完成测序,其余有5株菌株RRDR区未发生突变,剩余的37株在rpoB基因的RRDR区有不同位点及不同类型的变异,其中有2株在508和509位点发生缺失突变,其它突变的位点有511、516、526、531、533.多数突变位点集中在526位,突变类型包括His526Asn、His526Leu、His526Gly、His526Cys四种,其余位点突变形式为Leu511Pro、Asp516 Tyr、Leu533Pro.在511、516、526、533位点突变中,MIC测定除了一株突变类型为His526Leu的菌株为32 μg/ml外,其余位点突变均表现为低水平耐药或敏感,而531位点突变中Ser5 31Trp、Ser5 31Leu均表现为高水平耐药.结论 基于rpoB测序和MIC测定的结果显示特定rpoB基因突变可能导致结核分枝杆菌利福平耐药水平的改变,结核分枝杆菌利福平耐药(Xpert MTB/RIF)检测与(Bactec MGIT 960)检测结果不一致.

目的 评价高分辨率熔解曲线(high resolution melt,HRM)技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的临床应用价值.方法 用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的50株临床分离菌进行耐药性检测.以rpoB基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药.应用SPSS 17.0分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验结果为标准,计算两种方法的符合率.用x2检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异性.用Kappa检测分析两种结果的一致性.结果 药敏试验结果显示,50株菌中有1株为非结核分枝杆菌;49株中有20株同时对利福平和异烟肼耐药、1株仅对利福平耐药;HRM检测结果显示,21株对利福平耐药,28株为敏感株.以传统药敏试验为参考,HRM检测利福平耐药性的敏感性为86.36％,特异性为92.59％,经Kappa检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性.结论 HRM可快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值.

目的探讨GeneXpert MTB/RIF试验(简称Xpert)在检测利福平耐药及耐多药结核(MDR-TB)中的应用价值,并对Xpert与比例法利福平药敏结果不一致的原因进行分析.方法选取2014年1月至2016年6月在该院就诊患者所送检的临床标本进行Xpert检测、分枝杆菌培养,培养阳性菌株进行比例法药敏试验.Xpert与分枝杆菌培养均阳性共1 300例.以比例法药敏试验为"金标准",对Xpert检测利福平药敏结果进行分析.对Xpert与比例法检测利福平药敏结果不一致的菌株进行rpoB基因的利福平耐药决定区(RRDR)测序和最小抑菌浓度(MIC)的测定.结果Xpert检出利福平耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为99.31％、97.82％、92.88和99.80％.在Xpert检出利福平耐药的309例(初治125例,复治184例)患者中,以E、D和B探针突变检出为主,分别占65.70％、14.56％和10.68％;MDR-TB患者占比为77.35％(239/309),在初复治患者中分别占75.20％(94/125)和78.80％(145/184).在22株比例法敏感而Xpert检出耐药的菌株中,6株在RRDR区未检测到突变;16株在RRDR区检测到突变,以有争议的L511P突变(8例)和L533P突变(4例)为主.在2株比例法耐药而Xpert为敏感的菌株中,1株在RRDR区未检测到突变;1株在RRDR区外存在E546G突变.结论Xpert试验适用于利福平耐药结核分枝杆菌的快速检测,可用于MDR-TB的快速筛查.Xpert与比例法利福平药敏结果不一致主要与低度耐药相关的511、533位点突变有关.

目的 探索新一代高通量二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术在耐药结核病诊断中的应用价值.方法 搜集20162017年甘肃省结核病耐药基线调查150株临床分离株,排除非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)菌株2株,进行比例法药物敏感性试验(简称"药敏试验")及结核分枝杆菌耐药相关基因(包括katG、inhA、embB、rpoB、rpsL、rrs、gyrA和gyrB)的NGS技术检测,剔除测序失败的13株,最后纳入分析菌株135株.以比例法药敏试验结果为参考标准评价二代测序在耐药结核病中的检测效能.结果 以药敏试验结果为参考标准,NGS技术检测异烟肼、乙胺丁醇、利福平、链霉素、氧氟沙星耐药的敏感度分别为:88.75％(71/80)、85.71％(18/21)、84.72％ (61/72)、73.91％(51/69)、68.97％ (20/29),特异度分别为100.00％ (55/55)、86.84％(99/114)、96.83％(61/63)、96.97％(64/66)、99.06％(105/106),Kappa值分别为0.87、0.59、0.81、0.71、0.76.异烟肼耐药基因突变主要在katG 315位点上,突变频率为97.18％(69/71);乙胺丁醇耐药基因突变主要在embB 306位点上,突变频率为88.89％ (16/18);利福平耐药基因突变主要在耐药决定区,突变频率为93.65％(59/63);链霉素耐药基因突变主要在rpsL 43位点上,突变频率为79.25％(42/53);氧氟沙星耐药基因突变主要在gyrA 94位点上,突变频率为76.19％(16/21).结论 抗结核药物相关耐药基因NGS利福平、异烟肼、氧氟沙星耐药检测效能较好,能够满足临床结核病诊断需要.乙胺丁醇、链霉素已知耐药位点NGS耐药检测效能一般,需要对其耐药机制进行进一步的研究.

目的 探讨肺结核患者当中的结核分枝杆菌利福平基因发生突变的特征,同时分析其耐药情况,为耐药结核病的预防和治疗提供科学依据.方法 选取2016年6月—2018年12月杭州师范大学附属医院收治的肺结核患者532例,依据其痰液中的结核分枝杆菌耐药性分为耐药株(218株)及敏感株(314株).测定2组菌株的rpoB基因序列及最低抑菌浓度(MIC)值水平.结果 218株耐药菌株中180株为单重突变耐药菌株,rpoB基因结构分析发现,发生比率最高的突变密码子分别为526位(13.2％)、531位(74.4％).206株(94.5％)耐药菌株出现至少1个突变位点,且均位于耐利福平决定区(RRDR),12株(5.5％)耐药菌株突变位点在RRDR之外.有4株耐药菌株在RRDR之内发生同义突变,4株耐药菌株在RRDR之外发生同义突变.H37Rv密码子未发生任何突变.有8株敏感菌株发生同义突变在RRDR之外.单重突变菌株的RIF平均MIC值水平为(47.34±2.04)μg/mL,显著低于多种突变菌株平均MIC值水平[(118.24±3.95)μg/mL,t = 107.636,P ＜0.001].526单密码子平均MIC值水平与531单密码子突变菌株的MIC值水平比较差异无统计学意义(P ＞0.05).多重密码子突变菌株的MIC值水平为(116.03±5.06)μg/mL高于单重密码子平均MIC值水平[(47.08±1.31)μg/mL,t=85.530,P＜0.001].结论 利福平耐药性机制可能与rpoB基因的起始端531位、526位等突变相关,rpoB基因序列可用于预测结核分枝杆菌中的利福平耐药情况及表型.