该研究以鹅掌楸属植物为试验材料,在北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中筛选出54条GST基因家族的EST序列,通过比对将其归为Tau、Zeta、Theta和Phi等4个亚类.在这4个亚类中各选取1条EST序列设计引物,通过反转录PCR (RT-PCR)与cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从鹅掌楸属植物中克隆出4条全长分别为1 150、932、1 022和1 067 bp的基因,并分别命名为LtGS Tpa rCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1.对LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1这4个基因编码蛋白质的结构预测发现,其蛋白质的分子质量分别为25.17、25.34、24.49和28.09 kD;理论等电点分别是5.60、6.53、6.66和9.20,即LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a蛋白质属于酸性蛋白,LcGSTT1属于碱性蛋白;不稳定系数分别是33.01、36.97、43.19和47.96,即LtGSTparCb、LtGSTZ-like为稳定蛋白,LtGSTF13a、LcGSTT1为不稳定蛋白;α-螺旋(alpha helix)是这4个蛋白质二级结构的主要成分.利用在线软件TargetP并结合GST蛋白质在其他植物中亚细胞定位的结果,推测这4种蛋白质极有可能位于鹅掌楸属植物的细胞质内.实时荧光定量PCR分析结果表明,这4个基因在北美鹅掌楸各个组织中均有表达,其中LtGSTparCb和LtGS TF 13a在叶中的表达量最高,在其他组织中的表达量均较低;LtGSTZ-like在花器官中的表达量最高,在叶中的表达量最低,在其他组织中的表达量居于两者之间;LcGSTT1在叶中表达量最高,花器官中表达量其次,在茎和叶芽中的表达量偏低.该研究结果可为鹅掌楸属GST家族基因的功能研究奠定基础.

北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)是优良用材和绿化树种,但极不耐涝,阻碍了其广泛应用.本研究以前期试验筛选出的3个耐淹无性系(T4、T27和T37)和3个不耐淹无性系(S5、S9和S20)为实验材料,开展温室盆栽模拟淹水胁迫实验,通过比较丙二醛(MDA)含量、相对电导率(EL)、叶绿素含量,以及酶活性等生理生化指标的差异,探索不同无性系对淹水胁迫的响应和抗性差异.结果显示:北美鹅掌楸对淹水胁迫反应敏感,淹水4d时,耐淹无性系和敏感无性系均呈现下部老叶黄花,上部嫩叶、顶芽萎蔫现象,叶绿素含量减少,MDA、EL显著增加,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)等酶活性极显著增加.淹水6d后,敏感无性系受到的胁迫伤害进一步加剧,叶片萎蔫脱落,MDA、EL持续增加,叶绿素含量极显著降低,SOD和POD总体呈下降趋势;而耐淹无性系顶芽缓慢恢复,在叶片脱落后幼叶展开,叶绿素含量下降幅度较小,MDA和EL缓慢下降,SOD和POD持续升高,淹水20d左右近水面的茎端形成不定根和大量膨大皮孔.研究表明:耐淹型北美鹅掌楸可通过形成不定根和肥大的皮孔、保持较高的抗氧化酶活性等方式增强其抗涝能力;EL、叶绿素含量、SOD活性可作为北美鹅掌楸耐淹无性系中期选育指标.

密码子偏好性(codon usage bais,CUB)是指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象.本研究以35对引物获得的马尾松叶绿体全基因组为研究对象,利用CodonW、CAT1.3、EMBOSS等软件对马尾松叶绿体基因组中45条编码序列(coding sequences,CDS)进行了CUB分析,并将之与火炬松、北美鹅掌楸、杉木、雪松以及拟南芥等的叶绿体基因组CUB进行比较分析.分析显示,参试物种的叶绿体基因组都偏好以AT碱基结尾的密码子,且不同物种的CUB的偏性程度不同;中性绘图分析、ENC-plot以及PR2-plot偏倚分析等均表明:马尾松叶绿体基因组CUB在密码子第三位点上A/G的使用频率较高,且受到了选择等因素的影响;利用叶绿体基因密码子RSCU值对参试物种进行聚类分析发现,亲缘关系较近的马尾松与火炬松、雪松聚为一类,三者具有类似的密码子使用模式,也说明叶绿体密码子偏好性与亲缘关系存在一定的相关性.因此,叶绿体基因组CUB研究可以为系统进化的相关研究提供相关依据.

CPP(cystein-richpolycomb-likeproteinor Tesmin/TOS1-like)家族属于成员数目较少的一类转录因子基因家族,含有保守的富含Cystein的CRC结构域,在植物发育进程中,主要参与花发育、细胞分裂、分子进化等.为了探索CPP转录因子家族在北美鹅掌楸花发育中的作用,该文以北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)为材料,采用RACE技术克隆出1个CPP-like家族基因,命名为LtTCX2,全长2866 bp.通过NCBI网站在线分析,ORF长2424 bp,编码了807个氨基酸,含2个保守的TSO1-like CXC结构域,分子量为88699.25 Da,理论等电点为5.83,不稳定系数为62.38,疏水性平均值为-0.619,预测为亲水性蛋白、非跨膜蛋白、核蛋白,不含信号肽及切割位点.氨基酸比对及系统进化分析结果显示,LtTCX2与其他物种的CPP家族TCX蛋白具有较高的同源性,与亚洲莲(Nelumbo nucifera)的NnTCX2、胡杨(Populus euphratica)的PeTCX2进化关系最近.荧光定量PCR结果显示,LtTCX2基因在叶片中表达量最高,在萼片、花瓣中几乎不表达,表达量由高至低如下:叶片、花芽、雌蕊、雄蕊、茎、根、花瓣、萼片.以上结果说明,LtTCX2属于较古老、保守的一类基因,可为从分子生物学层面研究鹅掌楸属植物系统进化提供一定的理论依据.

法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS)是植物萜类物质合成前体法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)的关键合成酶.为探究北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)萜类合成途径的分子机制,该文利用北美鹅掌楸转录组数据,通过设计特异性引物,采用RACE技术克隆得到LtuFPPS1基因的全长序列并进行生物信息学分析.结果表明:(1)LtuFPPS1基因全长1460 bp,开放阅读框(ORF)长1056 bp,编码351个氨基酸,蛋白质分子量为40589.45 D,等电点为5.19,不稳定系数为43.50,归类为不稳定蛋白;LtuFPPS1基因所编码的蛋白不含信号肽,定位于线粒体,是一种不稳定亲水性蛋白,具有类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域,α-螺旋为其氨基酸序列的主要二级结构.(2)进化树和同源序列分析表明,北美鹅掌楸LtuFPPS1蛋白与乐昌含笑(Michelia chapensis)的FPPS蛋白的亲缘关系更近.(3)组织表达分析结果发现,LtuFPPS1基因在北美鹅掌楸雌蕊中的表达量最高,其高低顺序为雌蕊>花芽>茎>雄蕊>萼片>叶片>花瓣>根,据此推测萜类代谢物在花器官中的合成相对较多.综上所述,LtuFPPS1基因为萜类合成酶基因,可为从分子生物学层面探究北美鹅掌楸萜类物质的合成提供一定的理论帮助.

为深入探究叶原基分化成叶器官的形态建成机制,该研究以北美鹅掌楸为材料,采用RT-PCR和RACE克隆技术获得LtAGO1的cDNA全长和启动子序列并预测其功能,通过RT-qPCR分析LtAGO1在鹅掌楸属中的组织表达模式.同时,经抗性筛选和DNA鉴定获得ProAGO1∷GUS的转基因拟南芥株系,并进一步对T2代阳性植株进行表型和GUS组织化学染色分析.结果表明:(1)LtAGO1基因包含3300 bp的开放阅读框,编码1100个氨基酸,分子量为122.14 kD,理论等电点(pI)为9.36.(2)氨基酸序列分析显示LtAGO1含Gly-rich-AGO1和Piwi两个典型的AGO基因结构域,同源性分析显示LtAGO1蛋白与沉水樟AGO1蛋白(RWR84608.1)亲缘关系最近.(3)组织表达特异性分析显示LtAGO1在北美鹅掌楸不同组织间的相对表达量为雄蕊>花芽>花瓣>花萼>叶片>雌蕊>叶芽>茎,LtAGO1在北美鹅掌楸叶片不同发育阶段的相对表达量为叶芽萌动期>幼叶期>衰老期>成熟期,AGO1在鹅掌楸属叶缘的表达量高于叶片的其他部位且北美鹅掌楸叶凹陷部位的表达量高于叶尖部位.(4)获得叶中-侧轴向和基-顶轴向的极性缺失、叶缘锯齿、重瓣花型的转化株系,GUS组织染色显示ProAGO1启动GUS基因在叶芽顶端稳定表达且在新分化的叶柄上表达较强,在成熟期的茎、叶、花和果的维管束中均特异表达.LtAGO1启动子的GUS活性强度为叶顶芽>花>维管束,这与实时定量PCR结果相一致.综上认为,LtAGO1基因在顶端分生组织特异表达且受到多种途径的调控而参与到叶和花器官的发育进程中.该研究结果为进一步了解北美鹅掌楸LtAGO1基因的基本功能及其调控叶形发育机制提供了理论基础.