十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种重要植物病原细菌,在全球范围内侵染十字花科植物引起黑腐病,其σ因子在基因表达中起到重要调节作用.XC1193基因在Xcc 8004菌株编码一个σ-70因子,为进一步研究该σ因子在Xcc中的调控作用,利用自杀质粒pK18mobsacB构建了XC1193基因的缺失突变体DM1193.与野生型菌株的比较发现,XC1193基因突变不影响菌体在丰富培养基和基本培养基上的生长;突变体的胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等生化表型也与野生型一致;植株实验表明XC1193突变不影响过敏反应.采用剪叶接种法进行致病性检测,突变体致病力与野生型一致.而采用喷雾接种法,突变体致病力显著降低,互补菌株致病力恢复至野生型水平.结果表明,该σ因子在十字花科黑腐病菌致病过程中发挥作用,并与Xcc侵染寄主的早期事件有关.

双组分信号转导系统(two-component signal transduction system, TCSs)是微生物适应外界环境最重要的调控系统.十字花科黑腐病菌是引起十字花科黑腐病的主要致病菌,其中有111 个双组分调控基因,包括两个未知功能的基因:XC3981 和XC3982.为了研究其功能,我们通过同源双交换构建了这两个基因的缺失突变体,并对其进行表型检测及功能互补,结果表明缺失突变体DM3981 的致病力显著下降,蠕动性显著增加,互补菌株致病力和蠕动性都能恢复到野生型的水平,说明XC3981 与Xcc 的致病力和蠕动性相关;缺失突变体DM3982 与野生型相比无明显相差异.

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)能够侵染几乎所有的十字花科植物引起黑腐病,而纤维素酶作为重要致病因子之一,在病原菌早期侵染中发挥重要作用.通过全基因组检索发现,已测序菌株Xcc 8004中有9个基因(XC_0026,XC_0027,XC_0028,XC_0625,XC_0639,XC_0783,XC_0784,XC-1727和XC_2483)注释为纤维素酶基因.本研究构建了9个纤维素酶基因的单基因缺失突变体和多基因缺失突变体.定性检测突变体纤维素酶活,发现D0639的CMC纤维素酶活力显著降低,其他8个单缺失突变体的CMC纤维素酶活力变化不明显,当9个基因同时缺失即D9,CMC纤维素酶活性完全丧失.在D9的背景进行单基因反式互补,通过定量和定性检测纤维素酶活力,XC 0639能基本上恢复野生型水平,XC_0026、XC_ 0783和XC 1727只能补回10％的酶活力,而其余几个基因完全不能补回酶活力.本研究首次发现了XC_0639是十字花科黑腐病菌的纤维素酶的主效基因.

趋化性是有运动能力的细菌对环境中的刺激物产生的趋向或离避行为.在细菌的趋化系统中,能够感应环境中化学物质浓度梯度的化学受体称为趋化受体.十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是重要的植物病原菌,也是一种研究微生物与宿主互作机理的重要模式菌,然而关于Xcc中趋化受体的研究还较少.本研究利用生物信息学技术对Xcc8004中的21个甲基受体趋化蛋白(methyl-accepting chemotaxis proteins,MCPs)进行功能域分析并构建了系统进化树.结果 表明,Xcc中MCP具有比较高的保守性.利用同源双交换法构建了MCP编码基因的缺失突变体,对这些突变体的生物学功能分析表明:21个MCP编码基因突变后,皆影响Xcc对糖类、氨基酸等趋化物的趋化性;大多数突变不影响细菌的运动性,但XC_2311、XC_2304、XC_1937、XC_2223分别突变后,影响细菌的游动性和泳动性.

[背景]野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的致病菌.Xcc中DSF (Diffusible signal factor)信号依赖的群体感应系统和RpfB介导的群体感应退出机制均与其致病性密切相关.[目的]分别检测18种氨基酸对DSF-家族群体感应信号分子合成的影响,为研发新型生物防治方法提供思路.[方法]添加不同浓度的氨基酸到△rpfC菌株XYS培养体系中,接种后不同时间点取样提取DSF信号分子,利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)分析DSF和BDSF浓度.[结果]18种氨基酸中,甲硫氨酸、色氨酸和胱氨酸能有效降低△rpfC菌株培养体系中DSF和BDSF水平,抑制效果与氨基酸浓度密切相关;3种氨基酸对DSF信号分子的抑制作用存在叠加效应;甲硫氨酸、色氨酸或胱氨酸不影响△rpfC△rpfB双突变体菌株中DSF和BDSF水平.[结论]首次发现了甲硫氨酸、色氨酸和胱氨酸通过RpfB诱导Xcc退出群体感应状态.

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc),是引起十字花科植物黑腐病的病原菌.Xcc要经历寄生、腐生等多种环境变化,为适应这些环境变化,需要调控相应基因的表达.除蛋白外,小RNA在基因表达调控中也起到关键作用.本实验室前期实验从Xcc 8004中鉴定出数百个小RNA,但是绝大多数小RNA的功能仍然未知.本研究通过构建一个小RNA (sRNA3843)的过量表达株来研究其生物学功能.确定该小RNA过量表达后,对其过量表达株OE3843进行了一系列的表型检测.结果 发现,sRNA3843过量表达株OE3843对金属离子Cu2+、Zn2+、Cd2+及蛋白变性剂SDS的耐受能力明显下降,表明sRNA3843与Xcc的抗逆有关.本研究的实验结果为深入研究小RNA在Xcc抗逆中所起的作用及其作用机理打下基础.

[目的]植物病原细菌通过Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)将Ⅲ型效应物(type Ⅲ secreted effectors,T3SEs)分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能.本研究旨在确定Xcc 8004 Ⅲ型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位.[方法]利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息.通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端(1-1220 aa)和C端(1221-2030 aa)分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S::EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果.[结果]XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中.[结论]XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位.

tRNA衍生片段(tRNA-derived fragment,tRF)是一种由内切核糖核酸酶将初级tRNA(primary tRNA)或成熟tRNA分子剪切后形成的长度为14～30 nt(核苷酸)的稳定的RNA片段.研究表明,tRF广泛存在于各种真核生物中,它们既可以作为信号分子,又可以作为基因表达的调控因子,在细胞的各种生理过程中发挥重要的调控作用.但至今除了在大肠杆菌(Escherichia coli)和沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)中发现了 tRF外,在其他原核生物中未见有关tRF的报道.本研究采用高灵敏度的Northern杂交技术对十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的苏氨酸-tRNA(threonine-tRNA,tRNAThr)和甲硫氨-tRNA(me-thionine-tRNA,tRNAMet)进行了检测.结果显示,除了检测到全长的成熟tRNAThr 和tRNAMet外,还检测到多个丰度各异的稳定的tRF,而且一些tRF的产生受营养胁迫的诱导.此外,我们还发现,编码tRNAMet的基因XC4381已经退化为非编码RNA基因.本研究证明了 tRF在Xcc中的存在,为深入研究tRF的功能,特别是在Xcc致病中的作用奠定了基础.

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种维管束致病菌,能够引起寄主的黑腐病,是研究植物病原细菌与植物互作的一种重要模式菌株.在Xcc中,GntR家族的全局性转录调控因子HpaR1参与调控Xcc的运动、胞外多糖和胞外酶的合成等许多细胞过程,并与Xcc的过敏反应(hypersensitive response,HR)和致病相关;全局性转录调控因子Clp则参与调控胞外酶和胞外多糖的分泌与合成,并与黄单胞菌的致病相关.前期研究发现,Xcc中的转录调控因子HpaR1和Clp均能与糖苷水解酶(glycoside hydrolase)编码基因(命名为ghy基因)的启动子区结合.为探究转录调控因子HpaR1和Clp共同调控ghy基因表达的分子机理,本研究首先通过凝胶阻滞分析(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)发现HpaR1和Clp在体外能够结合在ghy基因的启动子区;利用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法,进一步证实HpaR1和Clp在细胞内能够结合在ghy基因启动子区.通过5'-cDNA末端快速扩增(rapid amplication of 5'-cDNA ends,5'-RACE)和DNase I保护实验(DNase I footprinting)确定HpaR1和Clp均结合在ghy基因启动子的–35区上游,并且HpaR1的结合位点位于Clp结合位点的上游.通过实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)和体外转录的方法,发现HpaR1抑制ghy基因的转录,而Clp激活ghy基因的转录.当二者共同存在时,HpaR1能够抑制Clp对ghy基因的转录激活作用.HpaR1和Clp单独存在时,分别负调控和正调控ghy基因的转录,推测HpaR1尽管位于ghy基因启动子-35区上游,但可能通过抑制RNA聚合酶的活性来调控ghy基因的表达.

原子力显微镜是1986年发明的一种用于观察样品表面纳米级三维结构的显微技术.近年来,越来越多的生物研究中开始使用原子力显微镜对生物样品的微观结构进行研究.与光学显微镜和电子显微镜的成像原理不同,原子力显微镜的观察主要依靠纳米级的探针对样品表面进行接触式扫描,无需对样品进行染色、包被处理即可获得样品三维高分辨率图像,同时还可以利用纳米探针对样品进行力学以及其它微操作,从而提供更多的生物特性与信息.黄单胞菌属致病菌是一类有广泛寄主范围的致病菌,其侵染对象涵盖众多瓜果、蔬菜,甚至水稻、木薯等粮食作物,危害极大.对黄单胞菌的功能基因组研究方兴未艾,然而,对黄单胞菌突变体的高分辨率个体表型观察、菌体解剖研究一直是空白.本研究利用原子力显微镜成功地对十字花科黑腐病病菌Xcc 8004菌株进行了表面结构观察,并对戊二醛固定样本进行了表面超微解剖,为黄单胞菌的功能基因研究提供了新颖的表型观察和研究手段.