目的:设计合成 68Ga-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-半胱氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(CDV)-Nb109，探讨其用于检测不同肿瘤中程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)表达水平的潜力。 方法:采用基因工程技术将CDV引入单域抗体Nb109序列的尾部，通过马来酰亚胺-半胱氨酸定点偶联策略，将马来酰亚胺-DOTA与CDV-Nb109(物质的量比1∶1)反应制备前体DOTA-CDV-Nb109，随后进行 68Ga标记并用PD-10脱盐柱纯化。建立人黑色素瘤A375、人源性PD-L1转染的A375-hPD-L1及人胶质瘤U87荷瘤裸鼠模型，通过稳定性分析、细胞摄取和microPET显像评价 68Ga-DOTA-CDV-Nb109的诊断价值。采用单因素方差分析和最小显著差异 t检验分析数据。 结果:68Ga-DOTA-CDV-Nb109放射化学产率为(69.79±4.69)%，放化纯大于97%，摩尔活度为(12.85±1.51) GBq/μmol。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109与A375-hPD-L1细胞具有较强的亲和力，解离常数( Kd)为(66.43±17.89) nmol/L。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109在A375-hPD-L1细胞[(3.17±0.15)百分加入放射性剂量(%AD)]、U87细胞[(2.08±0.03) %AD]中的摄取明显高于A375细胞[(1.21±0.14) %AD； F＝82.87， t值：15.23、9.98， P值：<0.001、0.003]。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109在A375-hPD-L1[(5.21±0.35)每毫升百分注射剂量率(%ID/ml)]和U87[(3.44±0.69) %ID/ml]荷瘤裸鼠肿瘤中的摄取显著高于A375荷瘤裸鼠[(2.17±0.36) %ID/ml； F＝249.72， t值：35.70、3.43，均 P<0.001]。 结论:成功制得定点标记的PET探针 68Ga-DOTA-CDV-Nb109，可无创、动态监测不同肿瘤中PD-L1表达水平的变化，在PD-L1免疫检查点阻断治疗潜在受益患者筛选方面具有应用潜力。

目的:制备抗白细胞介素1β（IL-1β）纳米抗体，并观察其对缺氧小鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:利用DNA重组技术，使用pET-16b和pHEN1表达载体构建抗IL-1β纳米抗体的重组质粒（pET-16b-4G6M-VHH、pET-16b-5BVP-VHH、pET-16b-5MVZ-VHH和pHEN1-4G6M-VHH、pHEN1-5BVP-VHH、pHEN1-5MVZ-VHH，其中VHH为重链单域抗体，4G6M-VHH、5BVP-VHH、5MVZ-VHH分别为3种抗IL-1β的纳米抗体），将构建成功的质粒分别转入大肠杆菌Rosetta2（DE3）表达菌中进行诱导表达及镍柱纯化，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹对表达产物及纯化产物进行鉴定，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其亲和力。将纯化所得亲和力最高的抗IL-1β纳米抗体（pHEN1-5MVZ-VHH）应用于小鼠HL-1心肌细胞缺氧模型（分为正常对照组、缺氧模型组、空白质粒组及12.5、25.0、50.0 μg/ml pHEN1-5MVZ-VHH处理组），并检测细胞存活率及凋亡率。结果:SDS-PAGE和Western印迹结果显示，成功得到相对分子质量约15 000的抗IL-1β纳米抗体；ELISA结果显示，与pET-16b载体组相比，pHEN1载体组所表达的纳米抗体与IL-1β抗原的亲和力更高（4G6M-VHH组：3.20±0.03比1.20±0.03， P<0.001；5BVP-VHH组：3.18±0.06比1.21±0.02， P<0.001；5MVZ-VHH组：3.38±0.05比1.62±0.04， P<0.001）；细胞存活及凋亡检测结果显示，与缺氧模型组相比，25.0 μg/ml及50.0 μg/ml pHEN1-5MVZ-VHH处理组HL-1细胞活性增加［（75.55±2.23）%比（46.90±2.51）%， P<0.001；（74.36±1.96）%比（46.90±2.51）%， P<0.001］，凋亡率降低［（6.83±0.27）%比（10.24±0.76）%， P<0.001；（6.68±0.38）%比（10.24±0.76）%， P<0.001］。 结论:pET-16b和pHEN1载体均能表达出抗IL-1β纳米抗体，且pHEN1载体表达的纳米抗体具有更好的抗原亲和作用。此外，pHEN1-5MVZ-VHH治疗可减少缺氧小鼠心肌细胞凋亡。

目的:评价前期获得的1株仅具有互补决定区3（CDR3）的单域抗体（sdAbs）NBL42作为纳米抗体亲和力移植通用框架的潜力。方法:采用亲和力转移的方法将分别结合蒜氨酸酶、程序性死亡受体-1（PD-1）、溶菌酶和CD47的4种抗体VHH-A4、VHH-H5、cAb-Lys3和B6H12的CDR3序列移植到NBL42对应的CDR3区。DNA合成获得4种仅具有CDR3的重组sdAbs，镍柱纯化并获得目的蛋白，间接ELISA法检测4种重组纳米抗体与抗原的结合及其热稳定性。用Swiss Model三维建模分析移植前后sdAbs的空间结构。结果:纯化后的4种重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中呈现单一条带，相对分子质量与预期相符。移植后的重组sdAbs NBL42-A4CDR3和NBL42-H5CDR3获得了与蒜氨酸酶和PD-1的特异结合能力，但结合活性降低了约50%，并转变为可溶性表达形式。移植后的重组sdAbs NBL42-L3CDR3和NBL42-B6H12CDR3完全丧失了对原抗原溶菌酶和CD47的结合能力。在热稳定性分析中，移植后的重组sdAbs NBL42-A4CDR3和NBL42-H5/CDR3保留了约50%的剩余结合活性。根据C88Y突变实验和Swiss Model三维建模分析，提示NBL42-FR3中88位半胱氨酸对于亲和力转移可能具有重要作用。结论:NBL42具有作为CDR3移植和亲和力转移框架的潜力。

目的:筛选并验证gasdermin D(GSDMD)单域抗体(single-domain antibody,sdAb)及其生物学功能.方法:利用原位邻近连接分析(in situ proximity ligation assay,isPLA)结合高通量测序筛选抗GSDMD sdAbs候选序列;利用isPLA、Co-IP、GST pull down、等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)验证这些sdAbs与GSDMD的特异性结合;在脂多糖(LPS)和nigericin处理的细胞焦亡模型中,观察细胞表型变化;检测细胞上清液中白细胞介素 1-β(IL-1β)水平变化以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放;通过Western印迹检测经上述处理后的细胞中GSDMD以及GSDMD N端结构域(GSDMD N terminus,GSDMD-NT)量的变化.结果:通过isPLA结合高通量测序方法筛选出GSDMD sdAb的候选序列,其中sdAb#26 与GSDMD C端结构域(GSDMD C terminus,GSDMD-CT)相互作用;与sdAb Con对照组相比,sdAb#26 处理高表达GSDMD细胞产生焦亡表型的细胞显著增多;细胞上清中释放的IL-1β以及LDH显著提高(t=68.54,P<0.001;t=5.909,P<0.01);GSDMD-NT产生量显著增加.结论:GSDMD sdAb具备操控GSDMD介导焦亡的潜力,为焦亡相关疾病的治疗提供了新思路.

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)家族的成员,其羧基端通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上.GPC3可与多种细胞表面受体相互作用,参与调节细胞的形态和黏附、增殖分化、侵袭迁移等生物学行为.GPC3在肝癌中的表达明显高于正常肝组织,且与肝癌的恶性程度、临床分期及预后密切相关.因此,GPC3被认为是肝癌靶向治疗的理想靶分子.近年来,基于抗体的肿瘤免疫治疗策略发展迅速,以GPC3为靶点的抗体治疗策略,如全抗体、单域抗体及嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗等取得了突破性的进展.我们总结了GPC3的功能及以GPC3为靶点的抗体治疗策略在肝癌中的研究进展.

目的 获得靶向人CD147的纳米抗体.方法 以胞外区全长CD147蛋白为靶标,从噬菌体展示文库中筛选CD147的纳米抗体,将筛选获得的单域抗体可变区(VHH)目的基因克隆至pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达纳米抗体,使用AKTA start+GE Ni-NTA预装柱对带有组氨酸(His)标签的重组蛋白进行纯化并用酶联免疫吸附实验、生物膜层干涉技术、蛋白质免疫印迹法及激光共聚焦显微镜成像技术检测纳米抗体的特异性和亲和力.结果 经过3轮筛选获得了1个特异性结合CD147抗原的纳米抗体12-3,其亲和力达到9.46×10-9 mol/L,且可特异性地识别肿瘤细胞表面的CD147抗原.结论 从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中筛选获得了1个高亲和力抗CD147的纳米抗体,有望用于肿瘤诊断.

本研究旨在人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 的结合多肽的基础上应用嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体,简化单域抗体制备过程,提高多肽生化稳定性.利用单域抗体通用骨架 (cAbBCII10),以 hCG 结合多肽取代互补决定区CDR1或CDR3,合成cAbBCII10嫁接抗体全基因序列并与sfGFP基因序列融合后,插入到带有His标签的原核表达载体pET30a(+) 中,成功构建了pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP与pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP融合蛋白表达质粒.将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白,得到高表达量的可溶性融合蛋白.利用Ni-NTA亲和柱纯化得到纯蛋白,应用SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白为正确表达的目标蛋白.通过抗原抗体结合实验,发现 hCG 结合多肽嫁接到单域抗体通用骨架的互补决定区CDR1或CDR3后都有抗原结合活性,具有相似的抗体滴度,且嫁接到CDR3后的抗原结合活性比CDR1要高(2-3倍).嫁接抗体基本保留了所用单域抗体框架较为稳定的生化特性,具有一定的热稳定性和较好的碱耐受性,同时,所接入的hCG结合片段对hCG具有较特异的结合活性,为进一步优化抗原结合多肽嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体提供了可靠的实验基础.

来自骆驼或鲨鱼的单域抗体(Single domain antibodies,sdAb)仅包含抗体的重链可变区,而从人抗体中筛选到的人sdAb中包含重链(Heavy chain,VH)或轻链(Light chain,VL)的可变区.与完整抗体和scFv(Single chain antibody fragment)相比,sdAb是体外和体内都稳定的非聚合分子.与scFv片段不同,sdAb是细胞质/细胞核蛋白质的新型抑制剂,并可以在细胞质中正确折叠.sdAb能特异性抑制翻译后修饰,如磷酸化位点,构象异构体或蛋白质的相互作用区域,这些区域不适合使用基因敲除及RNAi技术进行研究.作为细胞质/细胞核蛋白质的抑制剂,使用sdAb的研究数量持续增加,同时使用无需免疫动物的合成单域抗体文库中,研究者筛选出一些有成药应用前景的药物分子.目前,研究涉及的抗原靶点包括病毒蛋白、癌相关蛋白、毒素、神经系统相关蛋白、植物和果蝇蛋白等,可以针对几乎所有的细胞质/细胞核中的抗原表位,进行功能性sdAb的筛选.逃逸蛋白结构和细胞穿透肽的高效转染的研究,拓宽了sdAb的应用领域.新一代细胞特异性纳米颗粒,将携带细胞质/细胞核sdAb作为蛋白抑制剂,开拓病毒感染及癌症新的治疗领域.

传统IgG抗体分子一般由轻链和重链组成,轻链包含1个可变区(VL)和1个恒定区(CL),重链包含1个可变区(VH)和3个恒定区(CH1,CH2,CH3).单域抗体(Single domain antibody,sdAb),是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体,因其分子量小,也被称为纳米抗体(Nanobody). 20世纪90年代,单域抗体最早在骆驼科动物中被发现,之后在护士鲨、大星鲨和鳐鱼等软骨鱼纲动物中也发现了类似的抗体.单域抗体虽然结构简单,但仍然可以达到与传统抗体相当甚至更高的与特异抗原结合的亲和力.相比于传统抗体,单域抗体具有分子量小、稳定性强、易于重组表达等优点.近年来在生物学基础研究和医学临床应用方面均备受关注并被广泛应用.文中将从单域抗体的结构特征、理化性质、筛选方法及其在生物医学领域的重要应用进展进行综述.

抗体是实验研究和药物应用的重要工具.大多数抗体具有4条多肽链的对称结构,两条较长的重链和两条较短的轻链,两臂末端是相同的抗原结合部位.除了这些传统的抗体,羊驼、一些骆驼和鲨鱼体内会产生一种只含有重链的抗体,称为重链抗体.它们的抗原结合部位只由单一结构域构成.这类单域抗体具有分子小、可溶性好、热稳定性高和体内组织渗透性好等优点,引起了药物开发与免疫治疗应用等领域的广泛关注,具有很广阔的研究前景.文章主要概述了抗体药物的研究,单域抗体的特点及天然物种来源的单域抗体的研究概况.