目的 探讨N6-甲基腺苷(m6A)甲基化相关因子在骨骼肌损伤后修复过程中的时间动态表达及其对损伤过程中巨噬细胞炎症反应的调控作用.方法 建立BaCl2 损伤小鼠腓肠肌模型,对照组和损伤组每组 4 只小鼠.分别于小鼠损伤后第 1、3、5、7、9 天取腓肠肌组织进行实验;分离培养原代腓肠肌肌组织细胞,肌卫星细胞,肌细胞和培养成肌细胞系C2C12细胞,添加地塞米松(DEX,50 μmol/L)处理细胞模拟损伤;脂多糖(LPS,100 μg/L)处理巨噬细胞系RAW264.7 细胞模拟骨骼肌损伤后的炎症反应,LPS处理前添加STM2457(30 μmol/L)抑制m6A甲基转移酶 3(Mettl3)的作用.利用 Real-time PCR和 Western blotting方法检测 m6A甲基化相关因子(Writers,Erasers,Readers)的表达和炎症因子的表达.结果 肌纤维随着损伤时间的延长,出现溶解后逐渐修复,单核/巨噬细胞数量先增加后减少,配对盒 7(Pax7)mRNA水平随着损伤时间的变化先升高后降低.与对照组相比,腓肠肌中的m6A甲基化相关因子的mRNA水平和蛋白水平在损伤第 1 天时变化不显著,到损伤第 3 天显著升高(P＜0.05);损伤后第 5 天与第 3 天相比显著下降(P＜0.05);损伤后第 7 天和第 9 天与对照组相比差异无显著性.DEX降低了原代肌卫星细胞和C2C12 细胞m6A甲基转移酶因子的mRNA表达水平(P＜0.05),升高了甲基化识别酶因子的mRNA表达水平(P＜0.05).骨骼肌肌组织细胞和肌细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA水平在DEX处理后均显著升高(P＜0.05).LPS导致巨噬细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA和蛋白水平及炎症因子白细胞介素(IL)-6和IL-1β的mRNA表达水平显著升高(P＜0.05),而抑制Mettl3 之后,巨噬细胞炎症因子mRNA水平显著下降(P＜0.05).结论 m6A甲基化相关因子在受损的肌细胞和巨噬细胞炎症反应中被激活,抑制m6A甲基转移酶能够减弱巨噬细胞炎症反应.

背景:多裂肌的损伤、萎缩是临床各种腰背痛及功能障碍的主要来源之一,肌卫星细胞是肌肉干细胞,对肌肉的损伤修复起至关重要的作用.但目前尚缺少有关多裂肌卫星细胞分离培养方面的研究.目的:采用单根肌纤维法分离大鼠多裂肌卫星细胞并进行鉴定.方法:在体分离大鼠多裂肌,采用单根肌纤维法获得多裂肌卫星细胞,经反复差速贴壁法纯化,观察其形态变化并绘制细胞增殖曲线;以分化培养基进行诱导,观察其成肌分化情况;并采用免疫荧光法鉴定多裂肌卫星细胞标志蛋白Pax7、Myod、Desmin的表达.结果与结论:①单根多裂肌纤维经培养72 h后,可见肌纤维周围有大量长梭形或纺锤形细胞贴壁;②采用差速贴壁法纯化后,可见原代细胞呈圆形,高折光性,重新接种后24-48 h可贴壁,其生长呈"S"型;③以分化培养基诱导可出现较大肌管;④免疫荧光鉴定可见Pax7、Myod在肌卫星细胞的细胞核中为阳性反应,Desmin在细胞质中为阳性反应;⑤结果表明,单根肌纤维法可成功分离大鼠多裂肌卫星细胞,可用于未来多裂肌再生修复方面的研究.

目的 建立大鼠骨骼肌卫星细胞的分离和培养方法,探讨骨骼肌卫星细胞复合聚羟基乙酸(PGA)材料在体外共培养的可行性.方法 酶消化法获取原代骨骼肌卫星细胞,经体外培养和扩增后,组织学检测骨骼肌卫星细胞标志性蛋白的表达,将慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(GFP)转染后的骨骼肌卫星细胞接种于PGA上,形成骨骼肌卫星细胞-PGA材料复合物,体外培养1周后,进行光镜及扫描电镜观察.结果 培养的骨骼肌卫星细胞表达结蛋白(Desmin)和波形蛋白(Vimentin)阳性,光镜下观察显示转染后的骨骼肌卫星细胞在PGA纤维上增殖并分泌大量的细胞外基质,扫描电镜显示细胞分泌的细胞外基质将PGA纤维之间的孔隙充满.结论 转染后的骨骼肌卫星细胞复合PGA后生长良好,GFP可作为骨骼肌卫星细胞研究的示踪标记.

背景:自噬可促进低氧环境下肌卫星细胞的存活,然而基于自噬有明显的时效性,不同时间的自噬水平与肌卫星细胞增殖能力间的关系如何未见探讨.目的:探讨不同时间去血清饥饿对大鼠肌卫星细胞增殖能力及自噬微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)及Beclin1表达的变化.方法:原代分离培养雄性SD大鼠(广州中医药大学动物实验中心提供,体质量约120 9)多裂肌卫星细胞,取第3代细胞,培养至对数生长期后,分别设置正常血清组(体积分数10％胎牛血清)、空白血清(仅含培养基,无胎牛血清)6h组、空白血清12h组、空白血清24 h组,CCK-8检测各组细胞的增殖情况,并采用Western-blot法和RT-PCR法检测LC3及Beclin1蛋白及基因的表达.结果 与结论:①细胞增殖能力:空白血清诱导12h后细胞增殖能力较正常血清组及诱导6h时下降(P＜0.01),诱导24 h后细胞增殖能力较诱导12 h下降(P＜0.05);②LC3及Beclin1蛋白及基因的表达:空白血清诱导6h后,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ及Beclin1蛋白及基因的表达较正常血清组明显升高(P＜0.05),诱导12h及诱导24h后LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达较诱导6h时明显升高(P＜0.01),Beclin1的表达较诱导6h时升高(P＜0.05),LC3及Beclin1基因的表达较6h均升高(P＜0.05);③结果证实,去血清饥饿可以诱导肌卫星细胞发生自噬,自噬在去血清早期(12h内)可保护细胞的增殖能力,12h后细胞可出现过度自噬,不利于细胞的增殖.

目的 观察电针“委中”大鼠血清对大鼠腰多裂肌卫星细胞成肌分化因子MyoD、周期蛋白CDK4、P57和CyclinD表达的影响,从细胞周期角度分析电针“委中”血清促进损伤多裂肌再生修复的起效机制.方法 SD大鼠随机分为空白组、模型组和电针“委中”组,每组8只.通过肌肉注射0.5％布比卡因制备多裂肌损伤模型,电针组选取“委中”穴进行电针治疗,每日1次,每次20 min,第4日收集血清.培养原代大鼠腰多裂肌卫星细胞,随机分为空白血清组、模型血清组、电针“委中”血清组、抑制剂血清组(电针“委中”血清中加PI3K抑制剂LY294002),以对应血清分别培养1d,免疫印迹法检测肌卫星细胞MyoD、CDK4、P57和CyclinD蛋白表达.结果 造模后,各血清组MyoD、CDK4和P57表达水平均显著升高(P＜0.01);与模型血清组对比,电针“委中”血清组MyoD、CDK4升高(P＜ 0.05或P＜0.01)而P57显著降低(P＜0.01);与电针“委中”血清组对比,加入LY294002抑制剂后MyoD、CDK4降低(P＜ 0.05或P＜ 0.01)而P57显著升高(P＜0.01).与空白血清组对比,电针“委中”血清组CyclinD升高(P＜0.05),其他各组对比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 电针“委中”血清可通过上调MyoD、CDK4的表达,并下调P57的表达,加速肌卫星细胞增殖的周期性进程,促进损伤多裂肌的良性修复.

目的:观察电针血清对饥饿条件下肌卫星细胞成肌分化抗原(Myod)及自噬相关蛋白Beclin 1表达的影响,探讨电针调控肌卫星细胞增殖及自噬的机制.方法:电针"委中"穴7d后获取并制备不同浓度电针血清.分别以不同浓度(10％、20％、30％)的电针血清及10％胎牛血清对体外培养的原代肌卫星细胞干预12 h及24 h,CCK-8法检测各组细胞不同时间点的增殖情况,确定促进细胞增殖的最佳血清浓度.以无血清培养基培养原代肌卫星细胞12 h后,将细胞随机分为无血清组、10％胎牛血清组、最佳浓度电针血清组,分别加入相应浓度的血清.Western blot法检测不同血清干预12 h和24 h后原代肌卫星细胞中细胞增殖蛋白Myod及自噬蛋白Beclin 1的表达水平.结果:10％电针血清、20％电针血清、30％电针血清干预24 h后,肌卫星细胞增殖能力均优于10％胎牛血清(P<0.01),但3个浓度电针血清之间的肌卫星细胞增殖能力无明显差异(P>0.05),故取10％电针血清作为最佳浓度.Western blot结果显示:血清干预12 h后,无血清组肌卫星细胞中Myod及Beclin 1表达水平与干预前比较差异无统计学意义(P>0.05),10％胎牛血清组、10％电针血清组Myod表达水平较干预前升高(P<0.05)、Beclin 1表达水平较干预前降低(P<0.05);与同时点无血清组比较,10％胎牛血清组、10％电针血清组Myod表达水平升高(P<0.05)、Beclin 1表达水平降低(P<0.01).血清干预24 h后,无血清组Myod及Beclin 1表达水平较12 h时明显降低(P<0.01),10％胎牛血清组、10％电针血清组Myod表达水平较12 h时升高(P<0.05)、Beclin 1表达水平较12 h时降低(P<0.05);与同时点无血清组比较,10％胎牛血清组、10％电针血清组Myod及Beclin 1表达水平均升高(P<0.01,P<0.05).结论:饥饿条件下电针血清可改善肌卫星细胞的营养不良环境,抑制其凋亡趋势,促进肌卫星细胞增殖,这种作用可能是通过改善细胞的过度自噬实现的.

目的:观察电针血清调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路对肌卫星细胞自噬的影响.方法:原代培养多裂肌卫星细胞,选择传至第3代的肌卫星细胞,按本课题组前期的实验方法获取电针血清,先以空白血清(无血清,仅含培养基)干预细胞12h诱导肌卫星细胞自噬,后将各组细胞随机分为空白血清组、10％电针血清组、10％电针血清+LY294002组、3-MA组,各组分别干预12、24h后,采用CCK-8检测各组细胞的增殖能力,Western blot检测各组细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Beclin1、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Pax7蛋白的表达变化.结果:CCK-8结果显示,培养12h时,10％电针血清组细胞增殖能力优于其余3组(P＜0.05),培养24h时,10％电针血清组细胞增殖能力优于其余3组及12h时电针血清组(P＜0.01,P＜0.05),10％电针血清+LY294002组和3-MA组优于空白血清组(P＜0.01).Western blot结果显示:12h后,与空白血清组、10％电针血清+LY294002组比较,10％电针血清组和3-MA组p-Akt、Pax7蛋白表达显著升高(P＜0.01,P＜0.05),Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低(P＜0.01,P＜0.05).24h后,与空白血清组、10％电针血清+LY294002组比较,10％电针血清组和3-MA组p-Akt蛋白表达显著升高(P＜0.01),Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低(P＜0.01),10％电针血清组Pax7蛋白表达显著升高(P＜0.01);3-MA组Pax7蛋白表达显著高于空白血清组(P＜0.01).与12h时本组比较,空白血清组Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达均显著升高(P＜0.01),Pax7蛋白表达显著降低(P＜0.01),10％电针血清组Pax7蛋白表达显著升高(P＜0.05).结论:电针血清可改善肌卫星细胞的过度自噬,保护肌卫星细胞的增殖,该作用可能与激活PI3K/Akt通路有关.

目的 观察电针“委中”穴后的血清对大鼠腰多裂肌卫星细胞增殖、胶原蛋白Ⅰ (Collagen Ⅰ)、基质金属蛋白酶2(MMP2)表达的影响,从血清学角度探讨电针“委中”穴促进多裂肌损伤后修复的部分作用机制.方法 25只SPF级雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组、电针组,每组8只.腰4-5节段多裂肌注射0.5％的布比卡因建立多裂肌损伤模型.选取双侧“委中”穴进行电针治疗(20 min/次,1次/日,2/100 HZ,1-2 mA,共3次);正常组、模型组不予电针干预,第4d收集各组大鼠血清,制备无菌针刺血清.使用各组针刺血清培养原代MSCs,CCK-8检测MSCs增殖情况;WB检测Collagen Ⅰ、MMP2蛋白表达情况.结果 与正常血清组比较,模型血清组MSCs增殖速度加快(P＜0.01),Collagen Ⅰ、MMP2含量升高(P＜ 0.01,P＜0.05);与模型血清组比较,电针血清组MSCs增殖速度加快(P＜0.01),Collagen Ⅰ含量明显降低(P＜0.01),MMP2含量明显升高(P＜0.01).结论 电针“委中”后血清可能通过良性调节细胞外基质中Collagen Ⅰ、MMP2的表达促进MSCs增殖,加快受损多裂肌的再生修复过程.