N6-腺苷酸甲基化（m6A）是真核生物mRNA最常见的转录后修饰行为之一。m6A修饰可加速mRNA的代谢和翻译，在细胞分化、胚胎发育和免疫应答等过程中发挥重要作用。作为一种可逆的表观遗传修饰，m6A修饰在许多生理和病理过程中发挥着重要作用。m6A修饰与呼吸系统疾病的发生发展密切相关，m6A修饰调控因子可能成为调控呼吸系统疾病的潜在作用靶点。本文对m6A修饰在肺癌、急性肺损伤（ALI）、哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等呼吸系统疾病发生发展中的作用进行了综述，旨在为呼吸系统疾病的发病机制及药物作用靶点研究提供参考。

目的:探究N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）及其调节因子甲基转移酶3（METTL3）在子宫内膜癌非编码RNA中的作用。方法:定量检测浙江大学医学院附属第二医院临平院区2016年7月至2020年12月妇产科20例子宫内膜癌患者配对的癌和癌旁组织样本m6A及METTL3的表达水平。购自ATCC的HEC-1-A细胞系构建METTL3过表达及敲低的细胞。Western blot检测METTL3高表达和敲低细胞的METTL3、AKT/mTOR中关键分子的磷酸化水平；使用qRT-PCR定量检测METTL3高表达和敲低细胞的mRNA；使用RNA免疫共沉淀检测METTL3过表达及敲低细胞的m6A与其受体DGCR8的结合水平。结果:m6A RNA甲基化定量试剂盒检测结果表明，子宫癌组织中m6A（1.0 ± 0.15）vs（1.7±0.34）（ P<0.01）和METTL3（1.0± 0.13）vs（2.5±0.45）（ P<0.05）水平升高。过表达METTL3的miR-17-92细胞簇中，Western blot及qRT-PCR检测结果表明，METTL3过表达显著增加了pri-miR-17-92上的m6A修饰（ P<0.05），AKT/mTOR途径相关蛋白的磷酸化水平上调。此外，RIP检测结果表明DGCR8与pri-miR-17-92的结合显著提高。 结论:METTL3修饰m6A通过m6A/DGCR8依赖机制促进了pri-miR-1792加工成miR-17-92簇，进而激活了AKT/mTOR途径。

目的:探讨N6-甲基腺苷(m6A)修饰与非小细胞肺癌(NSCLC)淋巴结转移的相关性。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载NSCLC患者的转录组测序数据，共包含1 037例原发肺癌组织样本和108例癌旁组织样本。分析参与m6A修饰过程的调控蛋白在肿瘤组织和癌旁正常组织样本中表达水平的差异，利用加权基因共表达分析(WGCNA)算法识别与m6A调控因子存在共表达关系的信使RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)并根据RNA的表达模式对NSCLC患者进行共识聚类。采用 t检验比较聚类亚组间m6A甲基化丰度的差异，采用 χ2检验比较组间淋巴结转移发生率的差异。 结果:共纳入20个m6A调控因子，肿瘤组织中15个调控因子的表达水平显著上调[甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、YTH结构域蛋白1(YTHDC1)、YTH结构域结合蛋白1-3(YTHDF1-3)、异质核核糖蛋白A2B1(HNRNPA2B1)和HNRNPC、ALK B同源物5(ALKBH5)等]，3个调控因子显著下调[M0ETTL14、含锌指CCCH结构域蛋白13(Zc3h13)、脂肪和肥胖相关蛋白(FTO)]，差异有统计学意义( P<0.05)，YTHDC2和METTL16差异无统计学意义。通过WGCNA算法识别出454个与调控因子存在共表达关系的mRNAs和400个ncRNAs[325个长链非编码RNAs(lncRNAs)、23个微小RNAs(miRNAs)、28个核仁小RNAs(snoRNAs)、24个核内小RNAs(snRNAs)]。根据854个RNAs的表达模式进行共识聚类，将NSCLC患者分为2个聚类亚组(聚类1和聚类2)。WT1相关蛋白WTAP( t＝14.322， P<0.01)和HNRNPC( t＝15.424， P<0.01)等11个调控因子的表达水平在聚类1中均显著上调，其他9个调节因子在聚类亚组间差异无统计学意义，聚类1患者具有较高的m6A甲基化丰度。聚类1患者淋巴结转移发生率38.16%(292/765)明显高于聚类2组的22.27%(55/247)，差异有统计学意义( χ2＝19.487， P<0.01)。 结论:通过m6A甲基化与非小细胞肺癌淋巴结转移的相关分析，有助于探讨肺癌淋巴结转移相关机制。

目的:观察甲基化转移酶Wilms肿瘤蛋白1相关蛋白（WTAP）在缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞损伤中的调节作用及其分子机制。方法:①实验一：将H9C2心肌细胞分为空白对照组和H/R模型组。采用H/R诱导H9C2细胞建立心肌缺血/再灌注（I/R）损伤模型；空白对照组不进行处理。采用N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化测定试剂盒检测m6A水平；分别采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测甲基化转移酶〔WTAP、甲基转移酶样蛋白（METTL3、METTL14）〕的基因和蛋白表达水平。②实验二：将H9C2心肌细胞分为空白对照组、H/R+sh-NC组、H/R+sh-WTAP组。H/R+sh-WTAP组转染sh-WTAP以敲降WTAP表达，其余各组制模方法同实验一。转染48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡率；采用Western blotting检测WTAP、活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、活化多聚二磷酸腺苷酸核糖聚合酶（PARP）、转录激活因子4（ATF4）、蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）、磷酸化PERK（p-PERK）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的蛋白表达水平；采用免疫荧光染色观察ATF4阳性表达情况。③实验三：将H9C2心肌细胞分为空白对照组、H/R+sh-NC组、H/R+sh-WTAP和H/R+sh-WTAP+ATF4组。H/R+sh-WTAP+ATF4组用过表达质粒ATF4转染H9C2心肌细胞，其余各组制模方法同实验二。采用流式细胞术检测细胞凋亡率；采用Western blotting检测ATF4、CHOP、活化caspase-3和活化PARP的蛋白表达水平。结果:①实验一：H/R模型组m6A甲基化水平较空白对照组显著上调。RT-qPCR检测结果显示，H/R模型组METTL3、METTL14和WTAP基因表达水平均较空白对照组显著上调，以WTAP上调最显著；Western blotting检测结果呈相同趋势。提示甲基化转移酶WTAP的表达水平在H/R诱导的心肌细胞中显著上调。②实验二：H/R+sh-WTAP组细胞凋亡水平较H/R+sh-NC组明显减少〔（14.16±1.58）%比（24.51±2.38）%， P<0.05〕。Western blotting检测结果显示，H/R+sh-WTAP组WTAP、活化caspase-3、活化PARP、p-PERK、ATF4和CHOP的蛋白表达水平均较H/R+sh-NC组显著下调。荧光显微镜下显示，H/R+sh-WTAP组ATF4阳性信号较H/R+sh-NC组显著减弱〔（19.36±1.81）%比（32.83±2.69）%， P<0.01〕。提示敲降WTAP可抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡和内质网应激。③实验三：H/R+sh-WTAP+ATF4组细胞凋亡水平较H/R+sh-WTAP组显著增加〔（26.61±2.76）%比（17.14±0.87）%， P<0.05〕。Western blotting检测结果显示，H/R+sh-WTAP+ATF4组ATF4、CHOP、活化caspase-3和活化PARP的蛋白表达水平较H/R+sh-WTAP组显著上调。提示过表达ATF4可逆转sh-WTAP对H/R诱导的心肌细胞中内质网应激和细胞凋亡的抑制作用。 结论:甲基化转移酶WTAP可调节ATF4表达，介导细胞凋亡和内质网应激，促进H/R诱导的心肌细胞损伤。

目的:探讨RNA结合基序蛋白15(RBM15)与高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)患者预后的关系及对肿瘤细胞的生物学功能的影响。方法:在基因表达数据库(GEO)中用GSE69428和GSE40595数据集分析RBM15在HGSOC及正常组织中的表达，在Kaplan-Meier Plotter在线网站分析RBM15与HGSOC预后的相关性。通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测人正常卵巢上皮细胞以及卵巢癌细胞系中RBM15的表达。运用慢病毒转导技术进行RBM15敲降。采用平板克隆实验、细胞计数试剂盒(CCK-8)法细胞增殖实验Transwell迁移侵袭实验、药物毒性实验检测各组细胞的集落形成、增殖、迁移、侵袭能力及顺铂敏感性。采用 t检验或单因素方差分析进行统计分析。 结果:在GSE69428和GSE40595数据集中，RBM15基因在肿瘤组织中显著高表达(7.53±0.44比6.40±0.37， t＝6.215， P<0.01；6.18±0.46比5.61±0.20， t＝4.487， P<0.01)，且高表达组无进展生存期及总生存期显著高于低表达组。与正常人上皮卵巢细胞系IOSE80比较，RBM15在卵巢癌细胞系SKOV3及OVCAR3中的表达显著上调(1.56±0.09比1.00±0.04， t＝10.190， P<0.01；2.19±0.03比1.00±0.04， t＝42.360， P<0.01)。shRBM15组细胞表达明显低于shNC组细胞(SKOV3：0.59±0.05、0.78±0.04比1.00±0.04， F＝62.991， P<0.01；OVCAR3：0.27±0.01、0.45±0.03比1.01±0.13， F＝66.290， P<0.01)。shRBM15组细胞的集落形成能力明显高于shNC组(SKOV3：307±40、287±13比209±26， F＝9.715， P<0.05；OVCAR3：299±37、192±24比121±12， F＝34.591， P<0.05)。shRBM15组细胞的体外增殖能力明显高于shNC组(SKOV3：72 h 1.43±0.03、1.52±0.09比1.12±0.04， F＝40.240， P<0.01；OVCAR3：72 h 2.52±0.03、2.59±0.09比2.36±0.05， F＝9.753， P<0.05)。shRBM15组细胞的迁移能力明显高于shNC组(SKOV3：656±87、655±99比395±95， F＝12.771， P<0.01；OVCAR3：240±9、237±19比185±24， F＝13.729， P<0.01)。shRBM15组细胞的侵袭能力明显高于shNC组(SKOV3：971±109、876±160比649±65， F＝9.803， P<0.01；OVCAR3：325±37、349±38比220±55， F＝11.983， P<0.01)。在SKOV3细胞中，shRBM15组细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC 50)高于shNC组(13.91、12.13 μmol/L比9.17 μmol/L)。 结论:RBM15在HGSOC中高表达，且与较好预后相关。RBM15在浆液性卵巢癌细胞系中高表达，干扰RBM15的表达可以促进肿瘤细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭，并且影响细胞对顺铂的敏感性。

目的:探讨N6-甲基腺苷(m6A)修饰在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的变化，并探讨其机制。方法:将12只8~10周龄的C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表法分为对照组和LPS组。LPS组给予LPS(5 mg/kg)气管内滴注，对照组给予同等剂量生理盐水气管内滴注，12 h后取材，比较两组小鼠肺组织湿干重比。比较两组小鼠肺组织病理变化。应用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测炎性因子和相关基因表达水平。运用m6A甲基化免疫共沉淀测序(meRIP-seq)和RNA测序(RNA-seq)技术检测两组小鼠肺组织的m6A修饰水平和RNA水平，并采用生物信息学对结果综合分析。组间比较采用 t检验。 结果:LPS组小鼠肺湿干重比(7.56±0.34)高于对照组(3.99±0.54)，差异有统计学意义( t＝13.749， P<0.05)，且苏木精-伊红(HE)染色提示炎性细胞浸润和肺间质水肿程度加剧。LPS刺激增加小鼠肺组织炎性因子IL-1β(1.00±0.27比11.76±6.78)、IL-6(1.00±0.16比2.16±0.70)、TNF-α(1.01±0.09比1.93±0.73)的mRNA水平，差异有统计学意义( t＝3.447、3.692、2.843， P<0.05)。meRIP-seq共筛选出772个有表达差异的m6A甲基化位点，其中40.93%的位点显著上调。meRIP-seq和RNA-seq联合分析发现50个差异表达基因，包括B细胞易位基因1(BTG1)、心室区表达PH结构域1(VEPH1)、Toll样受体5(TLR5)和驱动蛋白超家族蛋白26A(KIF26A)等。 结论:m6A修饰在LPS诱导的ALI中发生变化，m6A修饰可能作用于BTG1、VEPH1、TLR5、KIF26A等基因，并在ALI中发挥作用。

目的 探讨N6-甲基腺苷(m6A)甲基化相关因子在骨骼肌损伤后修复过程中的时间动态表达及其对损伤过程中巨噬细胞炎症反应的调控作用.方法 建立BaCl2 损伤小鼠腓肠肌模型,对照组和损伤组每组 4 只小鼠.分别于小鼠损伤后第 1、3、5、7、9 天取腓肠肌组织进行实验;分离培养原代腓肠肌肌组织细胞,肌卫星细胞,肌细胞和培养成肌细胞系C2C12细胞,添加地塞米松(DEX,50 μmol/L)处理细胞模拟损伤;脂多糖(LPS,100 μg/L)处理巨噬细胞系RAW264.7 细胞模拟骨骼肌损伤后的炎症反应,LPS处理前添加STM2457(30 μmol/L)抑制m6A甲基转移酶 3(Mettl3)的作用.利用 Real-time PCR和 Western blotting方法检测 m6A甲基化相关因子(Writers,Erasers,Readers)的表达和炎症因子的表达.结果 肌纤维随着损伤时间的延长,出现溶解后逐渐修复,单核/巨噬细胞数量先增加后减少,配对盒 7(Pax7)mRNA水平随着损伤时间的变化先升高后降低.与对照组相比,腓肠肌中的m6A甲基化相关因子的mRNA水平和蛋白水平在损伤第 1 天时变化不显著,到损伤第 3 天显著升高(P＜0.05);损伤后第 5 天与第 3 天相比显著下降(P＜0.05);损伤后第 7 天和第 9 天与对照组相比差异无显著性.DEX降低了原代肌卫星细胞和C2C12 细胞m6A甲基转移酶因子的mRNA表达水平(P＜0.05),升高了甲基化识别酶因子的mRNA表达水平(P＜0.05).骨骼肌肌组织细胞和肌细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA水平在DEX处理后均显著升高(P＜0.05).LPS导致巨噬细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA和蛋白水平及炎症因子白细胞介素(IL)-6和IL-1β的mRNA表达水平显著升高(P＜0.05),而抑制Mettl3 之后,巨噬细胞炎症因子mRNA水平显著下降(P＜0.05).结论 m6A甲基化相关因子在受损的肌细胞和巨噬细胞炎症反应中被激活,抑制m6A甲基转移酶能够减弱巨噬细胞炎症反应.

目的 探讨AlkB同源蛋白5(AlkBhomolog5,ALKBH5)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的细胞增殖中的作用.方法 通过癌症基因组图谱数据库分析ALKBH5和前mRNA加工因子6(pre-mRNA processing factor 6,PRPF6)在HCC组织中的表达水平.采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测ALKBH5和PRPF6在HCC细胞系(Huh7和Hep3B)中的mRNA和蛋白表达水平.荧光原位杂交确定ALKBH5和PRPF6在HCC细胞系(Huh7和Hep3B)中的亚细胞定位.在免疫沉淀复合物中检测PRPF6的N6-甲基腺苷甲基化水平.通过过表达和敲低基因表达的方法,将Huh7细胞和Hep3B细胞分别进行转染,分组为sh-NC组(阴性对照转染细胞)、sh-ALKBH5实验组(ALKBH5干扰序列转染细胞)、sh-ALKBH5+ex-PRPF6实验组(ALKBH5干扰序列转染+PRPF6 pcDNA 3.1过表达质粒转染细胞),并采用CCK-8和染色增殖试验检测各组细胞的增殖情况.裸鼠异种移植瘤实验验证ALKBH5和PRPF6在体内的生物学功能.蛋白质印迹法检测各组细胞中AKT/mTOR通路相关蛋白的表达水平.结果 HCC细胞中ALKBH5的表达上调,可以去除PRPF6的甲基化修饰.体外和体内实验结果显示,ALKBH5可通过调节PRPF6的表达参与HCC细胞的恶性增殖.此外,敲低A LKBH5会抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化,而PRPF6的过表达则有助于AKT和mTOR的磷酸化.结论 ALKBH5能促进HCC细胞的增殖,相关机制是通过ALKBH5/PRPF6/AKT/mTOR轴实现的.

目的 分析刚地弓形虫感染对小鼠脑组织转录本的N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修饰水平的影响.方法 20只雌性C57BU6J小鼠随机分为TgCtwh6感染组(7只)、LHG感染组(7只)和对照组(TgCtwh6感染组、LHG感染组的对照各3只).TgCtwh6感染组、LHG感染组分别灌胃接种中国Ⅰ型wh6株(TgCtwh6)和中国Ⅲ型LHG株刚地弓形虫感染小鼠脑组织悬液0.2 ml(20个包囊/鼠),对照组灌胃等量的生理盐水.分别在接种后15、30和45 d,用抽签法随机抽取感染组小鼠各1只,麻醉后处死,取脑组织,于显微镜下分别记录大脑皮层区、海马区和嗅球区的包囊数.感染后45 d每组分别取3只小鼠的全脑组织,提取总RNA,制备基因组文库,进行转录组测序,筛选差异甲基化位点(DML),统计感染组和对照组的mRNA的差异m6A甲基化位点及其所在转录本;对甲基化位点所在转录本进行基因本体功能注释(GO)分析,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,对甲基化差异转录本进行基因集富集分析(GSEA).选取甲基转移酶样3(METTL3)、肥胖相关蛋白(FTO)和YTH结构域3(YTHDF3)等3种m6A甲基化修饰蛋白基因,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为内参,实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测其相对转录水平.结果 感染组小鼠均感染成功.感染后45 d,大脑皮层、海马和嗅球的包囊数分别为(5 676±10)、(4 773±9)、(243±10)个.感染组和对照组共检出760 650个甲基化位点,其中GGACA、GGACC、GGACT、ACGAT等4种 m6A模体的甲基化水平分别占 16.8％(127 923/760 650)、4.6％(35 164/760 650)、3.8％(28 983/760 650)和0.4％(3 122/760 650);共检出高甲基化位点所在转录本127 016条,其中GGACA、GGACC、GGACT和ACGAT所在的转录本分别为71 727、27 754、24 556和2 979条.感染组与对照组小鼠脑组织转录组中ACGAT、GGACA、GGACC、GGACT等4种m6A模体的DML位点总数为9 233,其中高甲基化位点4 832个,低甲基化位点4 851个.GO分析结果显示,DML所在转录本显著富集于生物过程中的细胞过程、细胞组分中的细胞和分子功能中的结合等功能.DML所在转录本的KEGG富集分析结果显示,分子间相互作用网络主要富集在溶酶体、剪接体和多巴胺能突触信号通路等途径中.对生物过程的GO富集分析结果显示,DML所在的转录本中,生物过程相关的部分转录本主要富集于蛋白糖基化、神经元凋亡负调控、蛋白质的入核转运等过程.GSEA分析结果显示,对照组和两个感染组的组间差异甲基化高分富集于成纤维细胞增殖负调控通路和Hippo信号通路相关的转录本子集中,其中筛选出 ENSMUST00000105393、ENSMUST00000006523、ENSMUST00000055261和ENSMUST00000038658等4个关键转录本,分别编码共刺激因子配体(ICOSL)、富含半胱氨酸肠蛋白1(CRIP1)、MOB激酶激活剂1A201(MOB1A201)和MOB1A202,与对照组相比,TgCtwh6感染组、LHG感染组的这4个基因表达均上调.qRT-PCR结果显示,TgCtwh6感染组、LHG感染组小鼠脑组织mettl3mRNA相对表达水平分别为5.47±1.09、1.63±0.06,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=4.05、5.03,均P＜0.05);ythdf3 mRNA相对表达水平分别为3.57±0.08、1.80±0.25,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=18.95、2.85,均 P＜0.05);fto mRNA 相对表达水平分别为 0.41±0.04、0.60±0.12,与对照组(1.00±0.06)比较差异有统计学意义(t=7.67、2.99,均P＜0.05);qRT-PCR结果与转录组测序获得的转录趋势一致.结论 弓形虫慢性感染可导致小鼠脑组织转录本m6A甲基化修饰水平升高,并可能通过对icosl、crip1和mob1a等关键差异转录本的修饰调控,造成宿主脑组织内与精神行为相关的生物学进程和信号通路的改变.

N6-甲基腺苷(m6A)修饰是RNA中最丰富的表观遗传修饰方式,动态可逆地调控各种生命过程.近期研究表明,m6A甲基化修饰及其调控因子在卵泡发育过程中必不可少,m6A甲基化修饰失调会导致女性生殖系统疾病,包括多囊卵巢综合征、早发性卵巢功能不全、卵巢衰老甚至宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌等妇科恶性肿瘤.本文对m6A甲基化修饰作用于卵泡发育过程和女性生殖系统疾病发生发展过程的相关研究进展作一综述,系统介绍m6A甲基化酶及其调控因子在卵泡发育和生殖系统疾病发生发展中的作用机制,旨在为女性生殖系统疾病预防、早期诊断和治疗提供新的检测方法和研究方向.