目的:评价Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)/受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)信号通路在脂多糖(LPS)-三磷酸腺苷(ATP)致小鼠巨噬细胞焦亡中的作用。方法:常规培养小鼠RAW264.7巨噬细胞，采用随机数字表法分为6组( n＝9)：空白对照组(C组)、LPS-ATP组、LPS-ATP＋转染阴性对照scRNA组(LPS-ATP＋scRNA组)、LPS-ATP＋ZBP1小干扰RNA组(LPS-ATP＋siRNA组)、LPS-ATP＋二甲基亚砜组(LPS-ATP＋DMSO组)和LPS-ATP＋RIPK1抑制剂nec-1组(LPS-ATP＋nec-1组)。LPS-ATP＋siRNA组使用siRNA技术抑制ZBP1的表达，LPS-ATP＋nec-1组给予nec-1抑制RIPK1的表达；C组常规培养，余5组给予10 μg/ml LPS孵育24 h，然后加入5 mmol/L ATP孵育30 min构建细胞焦亡模型。采用CCK-8法检测细胞存活情况；ELISA法检测细胞上清液IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α浓度；碘化丙啶荧光染色法测定细胞焦亡情况；Western blot法检测ZBP1、RIPK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)和消皮素D(GSDMD)表达。 结果:与C组比较，LPS-ATP组细胞存活率降低，细胞焦亡率升高，上清液IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α浓度升高，细胞ZBP1、RIPK1、caspase-1和GSDMD表达上调( P<0.05)；与LPS-ATP组比较，LPS-ATP＋scRNA组和LPS-ATP＋DSMO组上述各指标差异无统计学意义( P>0.05)；与LPS-ATP＋scRNA组比较，LPS-ATP＋siRNA组细胞存活率升高，细胞焦亡率降低，上清液IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α浓度降低，细胞ZBP1、RIPK1、caspase-1和GSDMD表达下调( P<0.05)；与LPS-ATP＋DSMO组比较，LPS-ATP＋nec-1组细胞存活率升高，细胞焦亡率降低，上清液IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α浓度降低，RIPK1、caspase-1和GSDMD表达下调( P<0.05)，ZBP1表达差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:ZBP1/RIPK1信号通路激活参与了LPS-ATP致小鼠巨噬细胞焦亡的过程。

目的:评价脊髓哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)/Gli1信号通路在小鼠慢性吗啡耐受中的作用。方法:健康雄性昆明小鼠，8～10周龄，体重23～25 g。实验Ⅰ　取小鼠50只，采用随机数字表法分为2组：生理盐水组(S组， n＝10)和吗啡组(M组， n＝40)。M组和S组分别皮下注射吗啡和生理盐水10 mg/kg，2次/d，连续7 d。于给药前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈，计算最大镇痛效应百分比(MPE)。M组于给药后1、3、5和7 d热痛阈测定结束后、S组于最后1次热痛阈测定结束后随机处死10只小鼠，取脊髓组织。实验Ⅱ　取小鼠40只，采用随机数字表法分为4组( n＝10)：KU-0063794+吗啡组(KU+M组)、二甲基亚砜(DMSO)+吗啡组(DM+M组)、吗啡+KU-0063794组(M+KU组)和吗啡+二甲基亚砜组(M+DM组)。4组皮下注射吗啡10 mg/kg，2次/d，连续7 d。于第1～3天每天吗啡注射前30 min时，KU+M组腹腔注射mTOR特异性抑制剂KU-0063794 200 μl(1 μg/μl)，DM+M组腹腔注射10%DMSO 200 μl，2次/d；于第5～7天每天吗啡注射前30 min时，M+KU组腹腔注射KU-0063794 200 μl (1 μg/μl)，M+DM组腹腔注射10%DMSO 200 μl，2次/d。于吗啡注射前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈，计算MPE。最后1次热痛阈测定结束后处死大鼠，取脊髓组织。采用Western blot法检测脊髓mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1和Gli1的表达水平。 结果:实验Ⅰ　与S组比较，M组给药后各时点MPE升高，给药后第3、5和7天时脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)。实验Ⅱ　与DM+M组比较，KU+M组注射吗啡后第3～7天时MPE降低，脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)；与M+DM组比较，M+KU组注射吗啡后第6和7天时MPE升高，脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:脊髓mTOR/S6K1/Gli1信号通路参与了小鼠慢性吗啡耐受的形成和维持。

目的:探讨受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)介导的程序性坏死在糖尿病因素取消大鼠七氟烷后处理心肌保护效应中的作用。方法:取糖尿病造模成功的大鼠80只，4~5周龄，体重90~100 g，采用随机数字表法分为4组( n＝20)：假手术组(Sham组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)、七氟烷后处理组(SP组)、七氟烷后处理+RIPK3抑制剂GSK-872组(GSK组)。采用结扎左冠状动脉前降支40 min，再灌注120 min的方法制备糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。SP组于再灌开始时吸入2.4%七氟烷15 min；GSK组于术前24、2 h时腹腔注射GSK-872 3.3 mg/kg(溶于生理盐水)，其他操作同SP组。再灌注120 min时，取腹主动脉血样，检测血清LDH和CK-MB浓度；取心肌组织，TTC染色法确定心肌梗死面积百分比，免疫组化法检测RIPK3的表达，Western blot法检测RIPK3、磷酸化钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)、磷酸化混合谱系激酶结构域样假激酶(p-MLKL)的表达水平，透射电镜观察心肌超微结构。 结果:与Sham组比较，I/R组血清LDH和CK-MB浓度、心肌梗死面积百分比升高，心肌组织RIPK3、p-MLKL和p-CaMKⅡ表达上调( P<0.05)，心肌细胞损伤严重。与I/R组比较，SP组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)。与SP组比较，GSK组血清LDH、CK-MB浓度和心肌梗死面积百分比降低，心肌组织RIPK3、p-MLKL和p-CaMKⅡ表达下调( P<0.05)，心肌细胞损伤程度减轻。 结论:糖尿病因素取消大鼠七氟烷后处理心肌保护效应的机制与其过度激活RIPK3介导的程序性坏死有关。

目的:评价膝关节炎慢性痛老龄大鼠术后神经认知障碍时海马受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体的关系。方法:健康雄性SD大鼠64只，18月龄，体质量500～550 g，采用随机数字表法分为4组( n＝16)：膝关节炎慢性痛组(P组)、膝关节炎慢性痛＋手术组(PS组)、RIPK1抑制剂Necrostatin-1 ＋膝关节炎慢性痛＋手术组(NPS组)和二甲基亚砜(DMSO)＋膝关节炎慢性痛＋手术组(DPS组)。采用左膝关节腔内注射碘乙酸盐(MIA)1 mg的方法制备膝关节炎模型并于12周后行七氟烷麻醉下剖腹探查术。NPS组和DPS组分别于术前1 h腹腔注射Necrostatin-1 6.25 mg/kg或等剂量DMSO。于关节腔内注射MIA前1周、注射后6和12周时测定热痛阈。于术后7 d时，采用Morris水迷宫实验评估认知功能；取海马组织，HE染色后光镜下观察病理学结果，采用Western blot法测定RIPK1、磷酸化RIPK1(p-RIPK1)、NLRP3、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cl-caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达，采用ELISA法测定IL-1β和IL-18的含量。 结果:4组大鼠MIA注射后6和12周时热痛阈较注射前降低( P<0.05)，4组大鼠各时点热痛阈比较差异无统计学意义( P>0.05)。与P组比较，PS组、DPS组和NPS组逃避潜伏期延长，原平台象限停留时间缩短，穿越原平台位置次数减少，海马组织RIPK1、p-RIPK1、NLRP3、cl-caspase-1和ASC表达上调，IL-1β和IL-18含量升高( P<0.05)，海马神经元发生明显病理损伤；与PS组和DPS组比较，NPS组逃避潜伏期缩短，原平台象限停留时间延长，穿越原平台位置次数增加，海马组织RIPK1、p-RIPK1、NLRP3、cl-caspase-1和ASC表达下调，IL-1β和IL-18含量降低( P<0.05)，海马神经元病理损伤减轻。 结论:膝关节炎慢性痛老龄大鼠术后海马RIPK1功能增强，进而激活NLRP3炎症小体，诱发神经炎症，可能参与术后神经认知障碍的发生机制。

程序性坏死是一种新近发现的区别于凋亡和自噬的细胞程序性死亡方式,由受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1、RIPK3和混合系激酶区域样蛋白介导.程序性坏死可由死亡受体和Toll样受体等激活而引发.近年研究发现程序性坏死在多种致盲性眼病的发生和发展中扮演重要角色.通过探讨程序性坏死的相关分子机制,就程序性坏死与多种致盲性眼病,如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性和青光眼的关系以及程序性坏死的潜在治疗靶点进行综述,以期为相关研究提供参考.(中华眼科杂志,2018,54:234-240)

受体相互作用蛋白(RIP)家族是一组苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶,具有相对保守的激酶结构域和不同的非激酶结构域,参与固有免疫应答、炎症等生理和病理过程.近年来研究表明,RIP家族通过参与坏死复合物的形成介导细胞坏死、触发炎症反应,其中RIP1和RIP3与细胞坏死的关系尤为密切.细胞坏死是一种精密调控的细胞死亡方式.通过TNF信号通路和Toll样受体信号通路传递的死亡信号可招募并磷酸化混合谱系激酶结构域蛋白,最终导致细胞崩解死亡,而细胞崩解后释放的胞内物质可触发炎症反应.本文着重阐述RIP家族介导细胞坏死和炎症发生所涉及的主要信号通路及分子机制,简述了RIP家族在相关炎症性疾病中的重要作用,并对RIP作为炎症性疾病治疗靶点的可能性进行了展望.

目的 评价骨髓间充质干细胞(BMSCs)对急性肺损伤大鼠肺组织雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响.方法 清洁级健康成年雄性SD大鼠,体外培养BMSCs.选取清洁级健康成年雄性SD大鼠105只,体重170～ 190 g,采用随机数字表法将其分为5组(n=21):对照组(C组)、PBS组、急性肺损伤组(ALI组)、急性肺损伤+BMSCs组(ALI+BMSCs组)、急性肺损伤+PBS组(ALI+PBS组).C组不作任何处理,PBS组尾静脉注射0.5 ml PBS;ALI组腹腔注射LPS 5 mg/kg(0.5 ml)制备急性肺损伤模型;ALI+ BMSCs组腹腔注射LPS后经尾静脉注射1×104/ml BMSCs(0.5ml);ALI+PBS组腹腔注射LPS后尾静脉注射PBS 0.5 ml.于静脉注射BMSCs后6、24和48 h时,采集动脉血样测定血气分析,随后取肺组织,测定肺湿/干重(W/D)比值,采用HE染色观察肺组织病理学变化,采用Western blot法测定肺组织mTOR、NF-κB及TNF-α的表达.结果 与C组比较,ALI组、ALI+BMSCs组、ALI+PBS组各时点pH值和PaO2降低,PaCO2和W/D比值升高,肺组织mTOR、NF-κB及TNF-α表达上调(P＜0.05).与ALI组比较,ALI+ BMSCs组各时点pH值和PaO2升高,PaCO2和W/D比值降低,肺组织mTOR、NF-κB及TNF-α表达下调(P＜0.05),肺组织病理学损伤减轻.结论 BMSCs减轻大鼠急性肺损伤的机制可能与抑制肺组织mTOR信号通路有关.

目的 探讨脂联素对子宫内膜癌HEC-1B细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)信号通路及胰岛素增敏效应的影响.方法 实验分为4组:脂联素组(Ad组,加入20μg/ml的脂联素作用30 min);抑制剂组(加入10μmol/L的AMPK抑制剂——复合物C作用30 min);脂联素+抑制剂组(Ad+抑制剂组,10μmol/L复合物C预处理30 min后,再加入20μg/ml脂联素作用30 min);对照组(仅加入无血清DMEM培养基).(1)荧光定量PCR技术及蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中脂联素受体(AdipoR)1、AdipoR2 mRNA和蛋白的表达水平.(2)以不同浓度(分别为2.5、5、10、20μg/ml)脂联素作用于HEC-1B细胞30 min,增敏实验时再加50 nmol/L胰岛素作用5 min;以20μg/ml脂联素作用于HEC-1B细胞不同时间(分别为15、30、45、60 min),增敏实验时再加50 nmol/L胰岛素作用5 min.蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中AMPK、mTOR、S6K1蛋白活化水平以及胰岛素受体底物1(IRS1)酪氨酸磷酸化水平.(3)活细胞计数(CCK-8)法检测4组HEC-1B细胞的增殖能力,体外穿膜实验检测4组HEC-1B细胞的迁移能力.结果 (1)在HEC-1B细胞中,AdipoR1 mRNA及蛋白的表达水平分别为8.50±0.09、0.91±0.03,明显高于AdipoR2 mRNA及蛋白(分别为1.00±0.00、0.69±0.03;P<0.05).(2)脂联素以时间、浓度依赖方式诱导HEC-1B细胞中AMPK蛋白活化水平增高但抑制mTOR、S6K1蛋白活化水平(P<0.05),且脂联素浓度为20μg/ml、作用时间为30 min时,AMPK蛋白的活化水平均达到峰值.脂联素以浓度依赖方式诱导IRS1酪氨酸磷酸化水平增高(P<0.05).(3)Ad组HEC-1B细胞增殖的抑制率为(0.68±0.34)％,Ad+抑制剂组为(0.24±0.04)％,两组比较,差异有统计学意义(t=17.88,P<0.05).Ad组穿膜细胞数为(77±8)个,Ad+抑制剂组为(132±13)个,两组比较,差异有统计学意义(t=-7.34,P<0.05).结论 脂联素通过AMPK/mTOR/S6K1信号通路发挥抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖的效应,并通过调控AMPK/S6K1/IRS1信号通路增加HEC-1B细胞对胰岛素的敏感性.

目的 评价Ⅰ型组蛋白去乙酰化酶( HDAC)在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及其与AMP依赖的蛋白激酶∕哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK∕mTOR)信号通路的关系.方法SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重210～220 g,腹腔注射柠檬酸盐-链脲佐菌素60 mg∕kg,建立Ⅰ型糖尿病模型,8周后用于实验.取糖尿病大鼠48只,采用随机数字表法分为4组( n＝12):假手术组(S组) 、心肌缺血再灌注组(I∕R组)、心肌缺血再灌注+I型HDAC抑制剂MS-275组( I∕R+MS组)和心肌缺血再灌注+MS-275+AMPK抑制剂Compound C组( I∕R+MS+CC组).采用结扎冠状动脉左前降支45 min,再灌注180 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型. I∕R+MS组腹腔注射MS-275 10 mg∕kg,连续7 d,1次∕d,给药结束后制备心肌缺血再灌注损伤模型;I∕R+MS+CC组于缺血前30 min静脉注射AMPK抑制剂Compound C 0.5 mg∕kg.于再灌注结束时,处死6只大鼠,测定心肌梗死体积;另取6只大鼠,右颈内动脉采血后处死,采用ELISA法检测血清CK-MB和LDH的水平,West-ern blot法测定心肌组织磷酸化AMPK (p-AMPK)、AMPK、磷酸化mTOR(p-mTOR)、mTOR、泛素结合蛋白(P62)和微管相关蛋白轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)、LC3Ⅱ的表达水平,计算 p-AMPK∕AMPK 比值、p-mTOR∕mTOR比值和LC3Ⅱ∕Ⅰ比值.结果 与SH组比较,I∕R组、I∕R+MS组和I∕R+M+CC组心肌梗死体积、血清CK-MB和LDH水平升高,I∕R+MS组心肌组织p-AMPK∕AMPK比值和LC3Ⅱ∕Ⅰ比值升高,p-mTOR∕mTOR比值降低,P62表达下调(P＜0. 05),I∕R组和 I∕R+ M+CC组心肌组织 p-AMPK∕AMPK比值、p-mTOR∕mTOR比值、LC3Ⅱ∕Ⅰ比值和P62表达差异无统计学意义( P＞0. 05);与I∕R组比较,I∕R+MS组心肌梗死体积、血清CK-MB和LDH水平降低,心肌组织p-AMPK∕AMPK比值和LC3Ⅱ∕Ⅰ比值升高,p-mTOR∕mTOR比值降低,P62表达下调(P＜0. 05),I∕R+M+CC组上述指标差异无统计学意义(P＞0. 05);与I∕R+MS组比较,I∕R+M+CC组心肌梗死体积、血清CK-MB和LDH水平升高,心肌组织p-AMPK∕AMPK比值和LC3Ⅱ∕Ⅰ比值降低,p-mTOR∕mTOR比值升高,P62表达上调( P＜0. 05).结论 Ⅰ型HDAC通过增强AMPK∕mTOR信号通路调控的细胞自噬水平,参与糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤.

目的 评价机械通气诱发小鼠海马神经元凋亡与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的关系.方法 健康雄性C57BL∕6小鼠50只,8～10周龄,体重20～25 g,采用随机数字表法分为2组(n=25):对照组(C组)和机械通气组(V组).C组自主呼吸,V组机械通气6 h.机械通气结束后1和3 d时行旷场实验和场景恐惧实验.机械通气结束后1 d时取海马组织,采用West-ern blot法检测mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的表达,计算p-mTOR∕mTOR比值;采用TUNEL法检测海马神经元凋亡指数.结果 与C组比较,V组中央区停留时间延长,跨格次数减少,僵直时间百分比降低,LC3Ⅱ表达上调,p-mTOR∕mTOR比值和凋亡指数升高(P<0.05).结论 机械通气诱发小鼠海马神经元凋亡的机制可能与mTOR信号通路激活有关.