目的:探讨腺苷酸活化蛋白激酶亚基α2(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2，Prkaa2）与核糖体蛋白S6激酶A1 （ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）的关系及Prkaa2对转化生长因子β1 （transforming growth factor-β，TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞纤维化的影响。方法:用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e细胞制备纤维化的细胞模型。采用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、蛋白质印迹法检测大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52e细胞（对照组）和10 ng/ml TGF-β1诱导12、24、36 h的NRK-52e细胞中Prkaa2的表达水平。于NRK-52e贴壁生长达30%时加入Prkaa2低表达慢病毒，转染72 h后收集细胞，并于Prkka2低表达慢病毒组及Prkaa2空病毒组中用qRT-PCR检测Prkaa2敲减效率。设立TGF-β1诱导、Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导3个实验组，同时以正常未作任何处理的NRK-52e细胞系为对照组。通过蛋白质印迹法检测Prkaa1、Prkaa2、α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、E钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cysteinyl aspartate specific proteinase9，Caspase9）和p53基因（p53）的表达。从Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组中分别选取3个生物学重复样本，通过Affymetrix基因表达谱芯片测序结果筛选差异表达的基因。然后，在Prkaa2RNAi+TGF-β1、Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导2个实验组中验证Prkaa2、Rps6ka1的表达。结果:qRT-PCR及蛋白印迹检测结果显示，TGF-β1诱导12 h时NRK-52e细胞中Prkaa2的mRNA和蛋白的相对表达量分别为1. 368±0. 083和1. 311±0. 007，与对照组1. 000±0. 123和1. 159±0. 009相比，差异有统计学意义（ P<0. 05）。qRT-PCR实验结果显示Prkaa2空病毒组相对表达量为1. 042± 0. 302，较Prkaa2低表达慢病毒组为0. 171±0. 165 ，Prkaa2 mRNA表达下调，差异具有统计学意义（ P= 0. 023）。蛋白质印迹法检测结果显示，TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为2. 89±0. 04，较对照组3. 82±0. 03下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 04±0. 04，较对照组1. 06±0. 05未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；TGF-β1诱导组α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为3. 60±0. 03、1. 07±0. 07、1. 81±0. 02、1. 17±0. 04、0. 62± 0. 01，均较对照组2. 95±0. 04、0. 74±0. 03、1. 00±0. 04、0. 77±0. 05、0. 37±0. 01上调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为3. 57±0. 03，较空病毒+ TGF-β1诱导组3. 04±0. 15上调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 03±0. 05，较空病毒+TGF-β1诱导组1. 05±0. 06未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa2、α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为0. 54±0. 02、3. 21±0. 07、0. 44±0. 03、1. 16±0. 08、0. 94±0. 03、0. 44±0. 03，均较空病毒+TGF-β1诱导组0. 89±0. 01、3. 49±0. 06、0. 98±0. 07、1. 87±0. 02、1. 21±0. 04、0. 65± 0. 03下调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Affymetrix基因表达谱芯片测序结果显示核糖体蛋白S6激酶A1(ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）下调。蛋白质印迹法和qRT-PCR验证结果提示，Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Rps6ka1表达相对表达量为0. 60±0. 02、0. 590±0. 026，较Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组1. 15±0. 04、1. 003±0. 080下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）。 结论:Prkaa2与Rps6ka1存在正向调控关系，抑制Prkaa2可以改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。

目的:评价脊髓哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)/Gli1信号通路在小鼠慢性吗啡耐受中的作用。方法:健康雄性昆明小鼠，8～10周龄，体重23～25 g。实验Ⅰ　取小鼠50只，采用随机数字表法分为2组：生理盐水组(S组， n＝10)和吗啡组(M组， n＝40)。M组和S组分别皮下注射吗啡和生理盐水10 mg/kg，2次/d，连续7 d。于给药前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈，计算最大镇痛效应百分比(MPE)。M组于给药后1、3、5和7 d热痛阈测定结束后、S组于最后1次热痛阈测定结束后随机处死10只小鼠，取脊髓组织。实验Ⅱ　取小鼠40只，采用随机数字表法分为4组( n＝10)：KU-0063794+吗啡组(KU+M组)、二甲基亚砜(DMSO)+吗啡组(DM+M组)、吗啡+KU-0063794组(M+KU组)和吗啡+二甲基亚砜组(M+DM组)。4组皮下注射吗啡10 mg/kg，2次/d，连续7 d。于第1～3天每天吗啡注射前30 min时，KU+M组腹腔注射mTOR特异性抑制剂KU-0063794 200 μl(1 μg/μl)，DM+M组腹腔注射10%DMSO 200 μl，2次/d；于第5～7天每天吗啡注射前30 min时，M+KU组腹腔注射KU-0063794 200 μl (1 μg/μl)，M+DM组腹腔注射10%DMSO 200 μl，2次/d。于吗啡注射前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈，计算MPE。最后1次热痛阈测定结束后处死大鼠，取脊髓组织。采用Western blot法检测脊髓mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1和Gli1的表达水平。 结果:实验Ⅰ　与S组比较，M组给药后各时点MPE升高，给药后第3、5和7天时脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)。实验Ⅱ　与DM+M组比较，KU+M组注射吗啡后第3～7天时MPE降低，脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)；与M+DM组比较，M+KU组注射吗啡后第6和7天时MPE升高，脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:脊髓mTOR/S6K1/Gli1信号通路参与了小鼠慢性吗啡耐受的形成和维持。

目的 探讨微小RNA 181b(miR-181b)是否通过调节自噬相关靶蛋白参与动脉粥样硬化发展.方法通过颈总动脉套环诱导ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成.通过尾静脉注射miR-181b慢病毒载体构建其过表达(miR-181bOE)及低表达(miR-181bKD)模型.检测血浆中脂质水平,苏木精-伊红染色对动脉粥样硬化斑块大小和体积进行定量,Western Blot检测自噬相关蛋白的表达.结果各组ApoE-/-小鼠血浆中总胆固醇 、三酰甘油 、低密度脂蛋白胆固醇水平均无显著差异(P>0.05).MiR-181bKD和miR-181bOE分别显著减少和增加颈动脉斑块面积和体积(F=118.95~322.03,P<0.05).MiR-181bOE可下调微管相关蛋白1轻链3膜结合型(LC3-Ⅱ)的表达,上调核糖体蛋白质S6激酶类70-kDa(p70S6K)表达,抑制自噬体形成;相反,miR-181bKD可上调LC3-Ⅱ 的表达,下调p70S6K表达,促进自噬体形成.差异均有显著性(F=107.38~398.13,P<0.05).结论抑制miR-181b可能通过下调p70S6K表达增加自噬活性,延缓颈动脉粥样硬化斑块的形成.

目的 探讨脂联素对子宫内膜癌HEC-1B细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)信号通路及胰岛素增敏效应的影响.方法 实验分为4组:脂联素组(Ad组,加入20μg/ml的脂联素作用30 min);抑制剂组(加入10μmol/L的AMPK抑制剂——复合物C作用30 min);脂联素+抑制剂组(Ad+抑制剂组,10μmol/L复合物C预处理30 min后,再加入20μg/ml脂联素作用30 min);对照组(仅加入无血清DMEM培养基).(1)荧光定量PCR技术及蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中脂联素受体(AdipoR)1、AdipoR2 mRNA和蛋白的表达水平.(2)以不同浓度(分别为2.5、5、10、20μg/ml)脂联素作用于HEC-1B细胞30 min,增敏实验时再加50 nmol/L胰岛素作用5 min;以20μg/ml脂联素作用于HEC-1B细胞不同时间(分别为15、30、45、60 min),增敏实验时再加50 nmol/L胰岛素作用5 min.蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中AMPK、mTOR、S6K1蛋白活化水平以及胰岛素受体底物1(IRS1)酪氨酸磷酸化水平.(3)活细胞计数(CCK-8)法检测4组HEC-1B细胞的增殖能力,体外穿膜实验检测4组HEC-1B细胞的迁移能力.结果 (1)在HEC-1B细胞中,AdipoR1 mRNA及蛋白的表达水平分别为8.50±0.09、0.91±0.03,明显高于AdipoR2 mRNA及蛋白(分别为1.00±0.00、0.69±0.03;P<0.05).(2)脂联素以时间、浓度依赖方式诱导HEC-1B细胞中AMPK蛋白活化水平增高但抑制mTOR、S6K1蛋白活化水平(P<0.05),且脂联素浓度为20μg/ml、作用时间为30 min时,AMPK蛋白的活化水平均达到峰值.脂联素以浓度依赖方式诱导IRS1酪氨酸磷酸化水平增高(P<0.05).(3)Ad组HEC-1B细胞增殖的抑制率为(0.68±0.34)％,Ad+抑制剂组为(0.24±0.04)％,两组比较,差异有统计学意义(t=17.88,P<0.05).Ad组穿膜细胞数为(77±8)个,Ad+抑制剂组为(132±13)个,两组比较,差异有统计学意义(t=-7.34,P<0.05).结论 脂联素通过AMPK/mTOR/S6K1信号通路发挥抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖的效应,并通过调控AMPK/S6K1/IRS1信号通路增加HEC-1B细胞对胰岛素的敏感性.

背景 2型糖尿病(T2DM)是常见的代谢紊乱性内分泌疾病,以高血糖为特征,长期高血糖状态可引起认知功能损害,表现为记忆和学习障碍、定向障碍、执行力障碍等.与T2DM常见并发症相比,关于中枢神经系统并发症的研究较少.目的 观察辛伐他汀对T2DM大鼠学习记忆能力的影响,探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)信号通路在辛伐他汀改善认知功能中的作用.方法 于2016年9月采用随机数字表法将120只健康雄性SD大鼠分为对照组(40只)、糖尿病组(40只)和辛伐他汀组(40只),糖尿病组和辛伐他汀组采用腹腔注射链脲佐菌素分别成功制备T2DM大鼠模型38、37只;辛伐他汀组大鼠采用辛伐他汀灌胃,对照组和糖尿病组大鼠灌胃等体积0.9％氯化钠溶液.饲养至32周行Morris水迷宫实验评估大鼠的记忆能力;显微镜下观察各组大鼠海马组织结构的改变,行Western blotting对mTOR、p70S6K、tau、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)表达水平进行分析.结果 糖尿病组和辛伐他汀组大鼠空腹血糖均高于对照组,体质量均低于对照组(P<0.01).糖尿病组和辛伐他汀组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均长于对照组(P<0.05);辛伐他汀组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均短于糖尿病组(P<0.05).显微镜观察显示,糖尿病组海马神经元数量减少,且排列紊乱,细胞膜皱褶,胞核缺失,细胞器减少;辛伐他汀组海马神经元细胞结构大致正常,数量略减少.糖尿病组和辛伐他汀组的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau均高于对照组(P<0.01);辛伐他汀组的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau均低于糖尿病组(P<0.01).糖尿病组和辛伐他汀组的MDA/β-actin、GSH/β-actin均高于对照组(P<0.01);辛伐他汀组的MDA/β-actin、GSH/β-actin均低于糖尿病组(P<0.01).结论 辛伐他汀能够改善T2DM大鼠认知功能,可能与mTOR/p70S6K信号通路的抑制和氧化应激产物生成减少有关.

目的:明确癫痫发作后外周血与脑组织中核糖体磷酸化S6蛋白(P-S6)含量变化的相关性.方法:取出生后5～6周龄的C57 BL/6小鼠30只和SD大鼠22只,采用红藻氨酸腹腔注射诱导癫痫发作.建立P-S6蛋白的流式细胞术检测方法用以检测小鼠及大鼠外周血中mTOR信号通路下游P-S6蛋白的变化,同时采用蛋白质印迹法检测其脑组织中P-S6的变化.采用Pearson相关性分析法分析脑组织与外周血中P-S6蛋白表达的相关性,并对大鼠外周血P-S6蛋白的表达与癫痫发作等级进行相关性分析.结果:癫痫小鼠外周血和脑组织中P-S6的含量明显增高,其表达量分别升高至对照组的(1.49±0.45)倍(P<0.05)和(2.55±0.66)倍(P<0.01);外周血中P-S6的阳性表达率和平均荧光强度均明显升高(均P<0.01),与脑组织中P-S6蛋白表达具有一致性(r=0.8474,P<0.01).大鼠自身致痫前后外周血中P-S6含量明显增加,由14.89±9.75增加至52.35±21.72(P<0.01),与大鼠脑组织P-S6蛋白表达变化一致(r=0.9385,P<0.01),且外周血P-S6含量的变化与癫痫发作等级呈正相关.结论:癫痫鼠外周血mTOR信号通路的变化与脑组织中的变化具有良好的相关性,提示通过检测外周血P-S6的表达水平可准确反映脑组织中mTOR信号通路的变化.

目的 比较HBV感染免疫耐受期产妇脐带血与正常产妇脐带血浆细胞样树突状细胞(pDC)中PI3K、mTOR、p70S6K、IFNα表达的差异.方法 选取湖南中医药大学第一附属医院产科住院部2017年10月-2020年1月HBV感染免疫耐受期产妇20例(乙型肝炎组)及正常产妇10例(正常组).分离培养脐带血pDC,在培养的第7天加入CpG-A,24 h后分别收集细胞及上清液,real-time PCR检测pDC PI3K、mTOR、p70S6K mRNA的表达,Western Blot技术检测pDC PI3K、mTOR、p70S6K蛋白表达,ELISA法检测pDC培养上清IFNα水平.计量资料采用两独立样本t检验.结果 乙型肝炎组HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表达水平显著低于正常产妇组(t值分别为-81.04、-63.07、-34.55,P值均<0.001);乙型肝炎组HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC PI3K、mTOR、p70S6K蛋白表达水平亦显著低于正常产妇组(t值分别为-8.13、-7.75、-6.71,P值均<0.001);乙型肝炎组HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC培养上清IFNα表达水平显著低于正常产妇组(t=-15.88,P<0.05).结论 HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC的PI3K、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达水平及IFNα水平减少,pDC功能受到抑制.

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)通路介导二十碳五烯酸(EPA)对快速老化小鼠肌肉功能的作用.方法 将40只SAMP8小鼠随机分为模型组、抑制剂组、EPA组、抑制剂+EPA组,各10只,另取8只正常老化SAMR1小鼠作为对照组.抑制剂组给予PI3K抑制剂LY2940027.5 mg·kg-1灌胃,EPA组给予EPA 70 mg·kg-1灌胃,抑制剂+EPA组给予LY294002+EPA灌胃,模型组和对照组灌胃等体积生理盐水,干预8周.检测小鼠肌肉力量强度,计算小鼠肌肉湿重与睾丸周围脂肪湿重变化.HE染色观察小鼠骨骼肌组织病理变化,评估肌纤维横截面积.Western blot法和qRT-PCR法检测小鼠骨骼肌中PI3K、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA表达水平.结果 与对照组相比,模型组小鼠抓力小,疲劳耐受时间短,肌肉和睾丸周围脂肪湿重轻,骨骼肌中磷酸化PI3K(p-PI3K)、p-mTOR、p-p70S6K蛋白相对表达量低(P＜0.05).与模型组比较,抑制剂组小鼠抓力更小,疲劳耐受时间更短,肌肉湿重、睾丸周围脂肪湿重更轻,骨骼肌中p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K蛋白相对表达量更低(P＜0.05);EPA组和抑制剂+EPA组小鼠抓力增大,疲劳耐受时间较长,肌肉湿重、睾丸周围脂肪湿重较重,骨骼肌中p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K蛋白相对表达量上调(P＜0.05).与对照组比较,模型组、抑制剂组肌纤维横截面积明显缩小,细胞核内移明显,抑制剂+EPA组肌纤维横截面积与细胞核内移有所改善,EPA组改善更明显.结论 EPA可能是通过激活PI3K/mTOR/p70S6K信号通路改善快速老化小鼠的肌肉功能.