目的:建立活的非可培养（VBNC）状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的绝对定量方法。方法:诱导高产乙醇肺炎克雷伯菌进入VBNC状态，评价乙醇产量。建立PMA-ddPCR方法通过单拷贝基因来计数高产乙醇肺炎克雷伯菌VBNC状态的活细胞基因拷贝数。进一步在VBNC状态粪便模拟中，评价ddPCR对低浓度样品检测的灵敏度和适应性。结果:对高产乙醇肺炎克雷伯菌梯度稀释液进行定量时ddPCR的检测下限是qPCR的10倍。在低温、低营养状态，高产乙醇肺炎克雷伯菌第45天进入VBNC状态，通过PMA-ddPCR对VBNC状态细胞进行定量结果为（5.46±0.05）log 10 DNA 拷贝数/ml。VBNC状态的乙醇产量为<2.2 mmol/L，复苏后恢复产乙醇能力。VBNC状态粪便模拟样品中ddPCR最低检测下限为3.2 log 10 DNA拷贝数/ml。 结论:建立VBNC状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的ddPCR检测方法灵敏度和适应性良好，可用于临床样品中VBNC状态细胞的检测。

目的:建立一种可以快速检测新型冠状病毒活性的方法。方法:将热灭活新型冠状病毒样本叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)处理和曝光后对RT-qPCR检测体系进行筛选，优化PMA预处理条件，建立新型冠状病毒PMA-RT-qPCR检测方法。以建立的检测方法对不同温度和含氯消毒剂灭活的病毒进行检测，评估其检测病毒活性的效果。结果:PMA-RT-qPCR检测方法的PMA浓度确定为200 μmol/L，孵育时间为10 min，曝光时间为15 min，以CDC ORF1ab检测体系进行扩增检测；活病毒PMA-RT-qPCR和直接进行RT-qPCR检测结果差异无统计学意义；95 ℃热灭活和含氯消毒剂灭活病毒在不同稀释度下PMA-RT-qPCR检测 Ct值显著高于对照组；70 ℃和56 ℃热灭活病毒只有部分稀释度PMA-RT-qPCR检测 Ct值高于对照组。 结论:建立的PMA-RT-qPCR新型冠状病毒活性检测方法对95 ℃热灭活和含氯消毒剂灭活病毒具有良好的检测效果，为判断样本中病毒的感染性大小提供了辅助手段。

细菌活性检测是检验、评价和保藏的关键,快速、灵敏、特异和准确的细菌活性检测方法是十分重要的.目前,细菌活性可以根据细菌生长繁殖能力、新陈代谢能力、细胞膜的完整性以及复制转录能力原理进行检测.不同的检测原理会有不同的检测方法,平板培养计数法是最为经典的活性检测方法,叠氮溴化丙锭结合定量聚合酶链反应(PMA-qPCR)、荧光染料结合流式细胞仪、单细胞拉曼分析技术等是新应用的方法.随着科学技术的不断发展和细菌活性检测的需求,优化的细菌活性检测方法层出不穷,但不同的细菌活性检测方法具有不同的优缺点.本文就目前细菌活性检测原理、方法、应用以及优缺点等方面进行描述,并探讨了细菌活性检测方法在细菌检验和保藏等方面的应用.

[背景]副溶血性弧菌为冰鲜产品及肉制品中常见的污染微生物,致病性强,危害严重,出入境运输及加工的肉食品常采取冷冻冷藏的处理手段来防止微生物污染及生长,以保持食物新鲜.而残留的部分副溶血性弧菌会进入活的非可培养状态(Viable but non-culturable state,VBNC),从而构成潜在的风险隐患.[目的]建立可用于冷冻食品中VBNC副溶血性弧菌的快速检测方法,并探讨其适用性.[方法]将大西洋鲑鱼1:10匀浆,加入终浓度为6.6×105 CFU/mL的副溶血性弧菌,-20 ℃分别诱导10、20、30和50 d.建立实时荧光PCR技术(qPCR)方法,测定其特异性、灵敏度及稳定性.利用PMA-qPCR法对不同冷冻时期样品中的副溶血性弧菌进行检测,同时与qPCR、平板培养法进行比较.[结果]建立的qPCR方法特异性好,与其他阴性参考株无交叉反应;灵敏度高,检测限为19.8CFU/mL;重复性好,Cq值的变异系数(CV)均在1.5％以下;标准曲线为y=-3.272x+45.310,线性回归系数R2为0.996,定量范围为1×102-1×109 CFU/mL.在低温诱导10-50 d后,qPCR法的Cq值在26.32-27.34之间,与诱导前相比几乎没有变化;叠氮溴化丙锭(PMA)-qPCR法的Cq值则从诱导前的26.43逐步上升到38.84,呈现明显的上升趋势,表明死菌的数量在显著上升.经过比较及统计,PMA-qPCR检测的活菌数均高于平板培养法测出的数量,差异显著(P＜0.05).[结论]PMA-qPCR特异性及灵敏度高,能有效抑制对死菌的扩增,同时能克服传统平板培养法对VBNC的漏检缺陷,可方便、快捷地用于冷冻食品中受损致病微生物,尤其是进入VBNC状态的细菌检测.

大量的分析方法可用于检测临床样品中的病毒,例如动物感染试验、细胞培养试验和聚合酶链式反应.核酸检测法有很高的敏感性和特异性,但是未能建立被检病毒基因组和病毒感染性间的关系.叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)-核酸检测法可弥补此缺陷,从而测定病毒的感染性.本综述描述了PMA-核酸检测法的原理和步骤,分析了PMA-核酸检测法的优势和局限,讨论了病毒结构、灭活方式和实验条件对PMA-核酸检测法的影响,并总结了该方法的研究进展.

目的 利用叠氮溴化丙锭(PMA)结合实时荧光定量PCR(qPCR)技术,建立应用于口岸消毒效果的快速评价方法.方法 针对细菌16S rRNA基因建立qPCR反应体系,以铜绿假单胞菌为对象,采用菌片浸泡定量杀菌试验对口岸常用含氯消毒剂(泰胜)进行消毒效果评价,分别比较培养计数法、qPCR和PMA-qPCR法评价消毒效果的有效性.结果 基于16S rRNA基因的qPCR法重复性好,灵敏度高,细菌最低检测浓度为63 cfu/ml;PMA处理对活菌无显著影响.对比3种检测方法发现,未经PMA处理的qPCR法检测消毒前后细菌数量变化较小,而PMA-qPCR法检测结果显示消毒后细菌数量显著下降(下降3.52个log值),且PMA-qPCR法的检测结果与传统培养法相近,说明PMA-qPCR法能有效抑制死亡细菌的扩增,真实反映消毒后的细菌存活情况.结论 建立的PMA-qPCR法进行口岸消毒效果评价具有快速、灵敏度高等优点,有望发展为口岸适用的快速评价消毒效果的有利工具.

[背景]乳杆菌属是发酵食品中最常见的微生物之一,与食品的品质和安全密切相关,定量检测乳杆菌活菌数、解析乳杆菌群落组成对发酵乃至肠道微生物等具有重要意义.[目的]建立一种在种水平上定量检测5种乳杆菌活菌数的叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR(propidium monoazide-quantitative PCR,PMA-qPCR)检测方法并探讨其适用性.[方法]以植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌等发酵食品中常见的5种乳杆菌为目标菌株,查找并筛选特异性引物用于荧光定量PCR(qPCR)检测,优化叠氮溴化丙锭(PMA)处理条件,测定PMA-qPCR检测法的特异性、灵敏度及可靠性.最后利用PMA-qPCR法检测黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数.[结果]PMA最佳处理条件为:浓度20μmol/L下暗处理15min后曝光15min,此时可抑制样品中99.89％的死菌DNA扩增.该方法特异性高,能够准确识别5种乳杆菌;线性关系强,R2＞0.98;灵敏度高,检测限为101.8-103.2CFU/mL;重复性好,Cq值变异系数小于1％;与平板计数相比差异不显著(统计学上),P＞0.05.利用该方法检测黄酒中5种乳杆菌的活菌数,发现发酵乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌是主要的乳杆菌(总计占比59％-89％),与已知黄酒酿造中乳杆菌群落组成相符.[结论]建立的PMA-qPCR法能够快速、准确地检测5种乳杆菌的活菌数,为解析样品中乳杆菌的实时组成及检测具有活性但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态的乳杆菌提供了可靠的手段.

目的:利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazid,PMA)预处理方法结合高通量测序技术检测口腔综合治疗台水路系统(dental unit waterline,DUWL)中活菌微生物群落,以综合评估不同科室DUWL中的污染情况及探究活菌群落构成的多样性.方法:选择南京医科大学附属口腔医院33台口腔综合治疗台,牙体牙髓病科23台(E组),牙周病科10台(P组),在医院开诊前收集三用枪水样,PMA预处理水样后提取活菌总DNA,经细菌通用引物PCR扩增后构建宏基因组文库,用于高通量测序和生物信息学分析.结果:样本使用1 μL PMA(最终浓度20 μmol/L)预处理10 min后暴露于卤素光照射5 min,最适合检测DUWL样品中活菌的量;高通量测序显示DUWL中活菌微生物群落呈多样性,并具有潜在的细菌致病序列.科室间具有统计学差异的菌门为蓝藻菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、衣原体门(Chlamydiae)、Aerophobetes、绿弯菌门(Chloro-flexi)、Bacteria_d_norank_k_unclassified、TM6(P＜0.05);属水平上,军团菌属(Legionella)、Methyloversatilis、Obscuribacterales_norank差异有统计学意义(P＜0.05).结论:DUWL中致病微生物的存在对牙科医务工作者和患者都具有潜在感染风险,应重视DUWL细菌群落的多样性,有必要对DUWL进行定期水质控制.

活菌的检测是病原菌检验的关键,目前快速、灵敏、特异和准确的检测方法,如定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)是微生物检测领域关注的焦点之一.其中,基于核酸结合染料如以叠氮溴化丙锭(propidium monoaz-ide,PMA)预处理的定量聚合酶链反应(PMA-qPCR)已广泛应用于多种病原菌活菌的检测,但仍然存在一定的局限性.现就PMA-qPCR检测与区分活菌(living bacteria)和死菌(dead bacteria)的研究进展作一综述.

目的 利用表面活性剂-叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMAxx)-qPCR反应体系对鲍曼不动杆菌进行快速表型药敏预测.方法 依次对加入反应体系中表面活性剂的种类和最适浓度、叠氮溴化丙锭曝光时间和浓度进行优化;采用qPCR检测鲍曼不动杆菌特异性鉴别基因(blaOXA-51)拷贝数;采用抗菌药物-细菌共反应体系测定鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性.结果 当表面活性剂月桂酰基甘氨酸钠浓度为0.2％,叠氮溴化丙锭最佳曝光时间和浓度为5 min和20 μmol/L时,能有效抑制死细胞DNA扩增,且不影响活细胞.基于此建立的表型药敏预测模型能快速(2h内)和准确地预测鲍曼不动杆菌对多西环素及左氧氟沙星的敏感性(P＜0.01),对头孢哌酮/舒巴坦的敏感性更可靠的预测需超过2h.结论 基于月桂酰基甘氨酸钠-PMAxx-qPCR体系的快速表型药敏预测新方法可在短时间内为鲍曼不动杆菌感染的治疗提供药敏依据,以指导其临床精准用药.