目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因多态性及血浆可溶性TRAIL（sTRAIL）水平与克罗恩病（CD）的关系，并回顾性分析TRAIL基因变异及血浆sTRAIL水平对英夫利昔单抗（IFX）临床应答的影响。方法:2012年1月至2021年1月，从温州医科大学附属第二医院消化内科收集312例CD患者［男205例，女107例，年龄（33.9±9.8）岁］和514名性别、年龄相匹配的正常对照者［男304名，女210名，年龄（34.9±9.4）岁］。患者中72例对传统药物治疗无效或不耐受的活动期CD患者接受IFX（5 mg/kg）规范治疗，第14周时依据Harvey-Bradshaw指数（HBI）和CD简化内镜评分（SES-CD）的变化分为应答组［HBI下降≥3分和（或）SES-CD下降≥50%］和无应答组。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱技术检测TRAIL（rs1131568）基因多态性，酶联免疫吸附法检测血浆sTRAIL水平。依据“蒙特利尔CD表型分类标准”将患者分层（确诊年龄、疾病部位、疾病行为）。全面分析rs1131568基因多态性和血浆sTRAIL水平与CD发病风险、临床病理特征及IFX临床应答的关系。结果:隐性模型分析显示，中重度活动期CD患者中rs1131568纯合子变异基因型（CC）的频率高于轻度活动期CD患者（45.34%比29.23%， P=0.005）。（狭窄型+穿透型）CD患者中rs1131568变异等位基因（C）和纯合子变异基因型（CC）的频率均高于非狭窄非穿透型CD患者（65.48%比57.53%， P=0.046；49.21%比31.18%， P=0.001）。显性模型分析发现，合并肛周病变的CD患者中变异等位基因（C）和变异基因型（TC+CC）的频率均高于无肛周病变的CD患者（66.83%比58.17%， P=0.037；92.31%比78.37%， P=0.002）。CD组中血浆sTRAIL平均水平高于正常对照组［（243.04±42.74）ng/L比（194.16±31.14）ng/L， P<0.001］。中重度活动期CD患者中血浆sTRAIL水平高于轻度活动期CD患者［263.47（242.09，281.91）ng/L比231.13（211.11，247.11）ng/L， P<0.001］。（狭窄型+穿透型）CD患者中血浆sTRAIL水平高于非狭窄非穿透型CD患者［266.18（246.68，289.91）ng/L比227.19（204.57，249.59）ng/L， P<0.001］。合并肛周病变的CD患者中血浆sTRAIL平均水平亦高于无肛周病变的CD患者［（261.40±41.51）ng/L比（233.86±40.41）ng/L， P<0.001］。CD患者中血浆sTRAIL水平分别与rs1131568纯合子变异基因型（CC）（β=16.814， P<0.001）和疾病活动度（β=22.640， P<0.001）呈正相关。IFX治疗第14周时，应答组（60例）血浆sTRAIL水平低于无应答组（12例）［（205.98（190.72，214.56）ng/L比（238.33±29.38）ng/L， P<0.001］，并且应答组的血浆sTRAIL水平较其第0周的基线平均水平降低［（205.98（190.72，214.56）ng/L 比（239.89±42.43）ng/L， P<0.001］。非条件logistic回归分析发现，应答组中rs1131568的变异等位基因（C）频率及变异基因型（TC+CC）频率均低于无应答组（53.33%比70.83%， P=0.037；70.00%比91.67%， P=0.036）。 结论:血浆sTRAIL水平增高可能是CD发病的风险因素。TRAIL（rs1131568）基因变异和血浆sTRAIL水平增高可能与CD疾病活动度增高相关，并可能是CD患者发生狭窄、穿透和肛周病变的风险因素。此外，TRAIL（rs1131568）基因变异或血浆sTRAIL水平增高可能与CD患者对IFX治疗无应答相关。

目的:探讨死亡受体5（DR5）在蛛网膜下腔出血（SAH）后早期脑损伤（EBI）中的作用及分子机制，以及可溶性DR5（sDR5）对SAH的神经保护作用。方法:实验1：将SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、SAH组（通过颈动脉穿刺法构建SAH模型），其中SAH组进一步分为SAH后6 h组、SAH后12 h组、SAH后24 h组、SAH后48 h组、SAH后72 h组，每组6只，通过Western blotting实验检测每组大鼠相应时间点肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和DR5表达情况，通过免疫荧光双染DR5与神经元核抗原（NeuN）判断DR5在神经元的表达情况。实验2：将SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、SAH组、Trail组（注射Dordaviprone）和Trail+sDR5组（注射Dordaviprone+sDR5），每组6只。于SAH模型构建成功后第24小时行Western blotting实验检测caspase家族蛋白水平、tBid表达水平，同时行Tunel染色及DR5、caspase-3免疫荧光双染。实验3：大鼠分组同实验2，于SAH模型构建成功后第5、7、12天分别行长时程运动功能评估，即改良Gracia评分、前肢放置实验、转棒实验和错步实验，于SAH后第14、16、18、20、21天行水迷宫实验检测大鼠长期学习记忆功能。结果:（1）实验1结果显示：假手术组、SAH后6 h组、SAH后12 h组、SAH后24 h组、SAH后48 h组、SAH后72 h组大鼠TNF-α、DR5表达水平差异均有统计学意义（ F=837.992， P<0.001； F=503.942， P<0.001），第24小时达到最高峰。SAH后DR5与NeuN免疫荧光双染共定位结果提示DR5定位在神经元。（2）实验2结果显示：与SAH组及Trail组比较，Trail+sDR5组活化caspase-8、tBid与活化caspase-3水平均明显降低，Tunel阳性细胞数均明显减少，DR5与活化caspase-3双染共标阳性细胞数均明显减少，差异均有统计学意义（ P<0.05）。（3）实验3结果显示：与SAH组和Trail组比较，Trail+sDR5组Garcia评分明显升高，前肢放置实验失败率明显降低，转棒上持续时间明显延长，足失误率明显降低，差异均有统计学意义（ P<0.05），提示sDR5可改善SAH后长期运动功能缺损。水迷宫实验结果显示，SAH后第21天，撤除平台后，与SAH组和Trail组大鼠比较，Trail+sDR5组大鼠在原平台象限的逃避时间和运动轨迹占总逃避时间和运动轨迹的比例均明显升高，差异均有统计学意义（ P<0.05），提示sDR5可改善SAH后长期学习记忆功能缺损。 结论:sDR5可抑制SAH后DR5-Trail介导的神经细胞凋亡并改善长期神经功能缺损。

目的 探讨ARHⅠ对TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823和MKN-28凋亡敏感性的影响.方法 以稳定转染pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-ARHⅠ质粒载体的BGC-823胃癌细胞系和稳定转染pU6、pU6-siARHⅠ质粒载体的MKN-28胃癌细胞系为模型,以200 ng/ml的重组人可溶性TRAIL作用于细胞24 h,采用流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bax、Bcl-2、活化caspase-3的蛋白表达.结果 过表达ARHⅠ显著增强了TRAIL诱导的BGC-823胃癌细胞凋亡,凋亡率由(6.85±1.77)%增加至(28.14±3.29)%(P<0.01),而下调ARHⅠ表达显著抑制了TRAIL诱导的MKN-28胃癌细胞凋亡,凋亡率由(35.02±3.89)%降低至(16.27±2.64)%(P<0.01);过表达ARHⅠ能够提高Bax表达2.37±0.18倍(P<0.01)、降低Bcl-2表达0.54±0.06倍(P<0.01),而下调ARHⅠ表达能够降低Bax表达0.45±0.08倍(P<0.01)、提高Bcl-2表达1.92±0.15倍(P<0.01).结论 调控ARHⅠ表达能够影响胃癌细胞BGC-823和MKN-28对TRAIL诱导凋亡的敏感性.

骨保护素(OPG)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一种可溶性分泌型糖蛋白,与核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、核因子κB受体活化因子(RANK)以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)共同组成骨保护素系统.大量临床及实验研究证实骨保护素系统参与内皮功能调节、炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等生理过程,其有望成为冠心病发生、发展、严重程度及其远期预后的生物学标志物,为冠心病的早期诊断及治疗提供新的可行途径.本文就骨保护素系统在冠心病发生、发展中的生物学效应、作用机制及未来的临床应用前景进行综述.

目的 研究精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,SPAG6)基因是否以P53依赖方式促进TRAIL诱导的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞凋亡.方法 通过P53kdRNA慢病毒转染人结肠癌细胞株HCT116筛选P53基因沉默的最佳靶点,利用筛选出来的最佳靶点序列转染SKM-1细胞;加入嘌呤霉素提高转染效率,RT-PCR及Western blot检验P53基因的干扰效果,构建SKM-1 P53kd细胞模型.用SPAG6kd RNA慢病毒载体转染SKM-1和SKM-1 P53kd细胞,RT-PCR及Western blot验证.用CCK-8法检测重组人可溶性TRAIL蛋白(rTRAIL)对SKM-1细胞的适宜作用浓度.Western blot检测rTRAIL处理后SKM-1和SKM-1 P53kd细胞株中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平.结果 构建了SKM-1 P53kd细胞模型,转染率在90％以上,P53基因在mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著降低(P＜0.01).SPAG6kd RNA慢病毒载体成功感染SKM-1细胞和SKM-1 P53kd细胞,转染率均在80％以上,SPAG6基因表达较对照组明显降低(P＜0.01).随着rTRAIL浓度的增加,细胞生长逐渐被抑制,30 ng/mL TRAIL诱导的细胞凋亡与对照组差异没有统计学意义,100 ng/mL和300 ng/mL TRAIL显著诱导SPAG6kd细胞凋亡(P＜0.05),而P53基因沉默与否并没有影响该结果,rTRAIL处理后细胞凋亡标志分子明显激活或水平升高,细胞中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平在SKM-1和SKM-1 P53kd细胞中差异无统计学意义(P＞0.05).结论 SPAG6基因以非P53依赖方式促进TRAIL诱导的MDS细胞凋亡.

目的 探讨立体定向血肿引流术治疗少量高血压脑出血的疗效,并分析其对患者血清可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)表达的影响.方法 回顾性选择2013年7月至2017年2月收治的少量高血压脑出血患者66例为观察组,另选择同期接受体检的45例健康志愿者为正常对照组.比较两组血清sIL-2R、TRAIL表达水平.依据治疗方法的不同将观察组分成手术组(n=33)与非手术组(n=33),比较其治疗前后sIL-2R、TRAIL水平及美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分情况.结果 观察组治疗前血清sIL-2R水平为(102.55±17.18) pg/ml,明显高于对照组血清sIL-2R(45.32±9.83)pg/ml(P＜0.05);观察组治疗前血清TRAIL水平为(3.35±0.86)pg/ml,明显高于对照组血清TRAIL(1.47±0.32) pg/ml(P＜0.05).治疗1个月后,手术组血清sIL-2R、TRAIL水平分别为(52.06±9.84) pg/ml、(1.91±0.28) pg/ml,均显著低于非手术组(P＜0.05).治疗14 d、治疗1个月后,手术组NIHSS评分分别为(8.7±0.6)分、(4.46±0.3)分,均显著低于非手术组(P＜0.05).结论 立体定向血肿引流术可有效降低少量高血压性脑出血患者血清sIL-2R、TRAIL的表达水平,促进患者神经功能恢复,值得临床应用及推广.

骨保护素(OPG)是TNFR超家族的一种可溶性的分泌型糖蛋白[1],主要由成骨细胞和血管内皮细胞生成,其他组织如心脏、肾脏、肝脏、脾脏等亦可分泌.OPG主要通过RANKL/RANK/OPG系统[2]、TRAIL信号通路[3]在骨代谢、免疫炎症反应及心血管疾病中发挥重要作用,与糖尿病及其并发症、骨质疏松、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病密切相关.近几年,OPG在慢性肾脏病(CKD)患者骨代谢、心血管事件(CVE)等方面的作用和机制已成为国内外研究的热点.本文就目前OPG在CKD的研究进展作一综述.

目的:重组表达人单链TRAIL(single-chain TRAIL,scTRAIL)及研究其在抗肿瘤中的作用.方法:通过重组PCR获得编码scTRAIL的基因序列,构建含编码scTRAIL基因的重组质粒,将重组表达质粒转化到大肠埃希菌(E. coli)BL21(DE3),通过IPTG诱导,破碎细菌,上清行Amylose Resin亲和层析初步纯化融合蛋白.通过MTT法检测融合蛋白对人胰腺胆管上皮细胞SW1990、人大细胞肺癌NCI-H460和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖抑制作用.结果:成功构建并克隆编码scTRAIL的基因序列,经IPTG诱导表达,表达产物的表达量约占菌体蛋白的20%左右,获得了相对分子质量约为110 kD的可溶性重组蛋白MBP-scTRAIL . MBP-scTRAIL分别作用于NCI-H460和SW1990,其增殖抑制作用IC50分别约为111 ng/ml和250 ng/ml,且MBP-scTRAIL增殖抑制率明显高于 TRAIL114-281(P ＜0. 01 ).结论:scTRAIL的抗肿瘤效果优于单体TRAIL114-281,是一种安全、有效的抗肿瘤生物制品.

目的 制备特异性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体单克隆抗体,为建立TRAIL酶联吸附检测方法 奠定基础.方法 以原核表达系统重组制备的可溶性人sTRAIL作为抗原,利用杂交瘤技术筛选获得抗人TRAIL mAb杂交瘤细胞株.体内诱生法生产腹水,经间接ELISA方法 检测腹水效价,Western blot鉴定抗体特异性.结果 制备获得一株可稳定分泌抗人TRAIL mAb的杂交瘤细胞株,属IgG2b亚类;腹水效价达1:5x106以上,Western blot鉴定结果显示可特异性识别人TRAIL,而与TNF-α和Fas-1无明显的交叉反应.结论 制备了具有高特异抗原结合特性的TRAIL mAb..

目的:探讨环化变构肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(CPT)诱导外周血破骨细胞凋亡作用及其分子机制.方法:外周血单个核细胞(PBMC)经巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)及可溶性核因子κB受体活化因子配体(sRANKL)诱导培养成熟破骨细胞,采用不同浓度的CPT诱导破骨细胞凋亡,应用Annexin V-FITC荧光染色法检测CPT诱导破骨细胞凋亡,RT-PCR检测破骨细胞中CPT受体mRNA表达变化的影响.结果:PBMC在RANKL和M-CSF细胞因子诱导下培养21 d,均生成了具有骨吸收活性的破骨细胞.在2×106的接种密度下诱导产生破骨细胞的数量(细胞因子含量:30 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF)在5×105接种密度下(细胞因子含量:30 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF)的2倍.通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色后,不同浓度(0、100、500 ng/ml)CPT作用正常人的破骨细胞24 h和48 h后,出现明显的细胞凋亡特征,Annexin V-FITC染色后,经荧光显微镜观察,0 ng/ml CPT诱导的对照组极少细胞被染色(绿色荧光);对比发现100、500 ng/ml CPT诱导的给药组中出现大量绿色荧光阳性细胞,进一步研究显示,100、500 ng/ml CPT处理破骨细胞24 h后,破骨细胞凋亡率由1.7％(0 ng/ml)上升到9.1％(100 ng/ml)和13.7％(500 ng/ml),差异有统计学意义(P＜0.05);处理48 h后,由2.1％(0 ng/ml)上升为13.8％(100 ng/ml)和21.9％(500 ng/ml),差异有统计学意义(P＜0.05),并且发现48 h凋亡数量明显多于24 h(P＜0.05).不同浓度的CPT(100 ng/ml、500 ng/ml)处理破骨细胞24 h后,TRAIL的相关死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、诱骗受体1(DcR1)及诱骗受体2(DcR2)的mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05),处理48 h后,DR5的mRNA表达量由1.20±0.26(0 ng/ml)下降为1.00±0.26(100 ng/ml)、0.60±0.09(500 ng/ml),差异有统计学意义(P＜0.05).结论:CPT能以时间-浓度依赖性的诱导外周血源破骨细胞凋亡,其作用机制可能是通过下调DR5的mRNA表达水平诱导其凋亡.