目的:建立基于SYBR Green I颜色判定的检测新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）ORF1ab基因的逆转录环介导等温扩增方法（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP），为诊断SARS-CoV-2提供简便、快速和准确可靠的工具。方法:基于GenBank中SARS-CoV-2 ORF1ab基因序列保守区设计引物，经引物筛选和RT-LAMP反应体系优化后进行灵敏度和特异性评价，并与实时荧光定量RT-PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法进行比较。结果:基于颜色判定的RT-LAMP方法可在65℃45 min内完成SARS-CoV-2的快速检测，检测限为3 copies/reaction，与qRT-PCR的敏感度一致。RT-LAMP检测人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和乙型流感病毒核酸样本结果为阴性，具有较好的特异性。经SARS-CoV-2临床样本验证，RT-LAMP与qRT-PCR的检测符合率达100%。结论:基于颜色判定的RT-LAMP方法灵敏度高、特异性强，适用于SARS-CoV-2的快速可视化检测，具有应用于SARS-CoV-2样本的初筛及基层卫生医疗机构和现场推广的潜力。

建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)检测利什曼原虫的方法,为内脏利什曼病防治提供技术支持.根据利什曼原虫动基体5.8S核糖体RNA(GenBank:OP829811)序列,设计合成LAMP扩增特异性引物,建立LAMP法.用LAMP法检测恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫感染者和健康人血样DNA,以及日本血吸虫、刚地弓形虫和杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA,评价LAMP法的特异性评价特异性;杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA稀释为 1 ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1 pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1 fg/μl,确定LAMP法的最低检测限及有、无钙黄绿素对检测限的影响.用建立的LAMP法和实时荧光定量PCR(qPCR)检测不明原因发热患者和健康人血样;取阳性患者骨髓涂片吉氏染色后镜检,查找利什曼原虫无鞭毛体.建立的LAMP法可检出杜氏利什曼原虫DNA,反应结果呈绿色;检测4种疟原虫感染者和健康人血样以及日本血吸虫、刚地弓形虫DNA的结果均为阴性,呈橙色.LAMP法检测健康人血样46份,均呈阴性,无交叉反应,特异性高.65 ℃反应60min,未加和加钙黄绿素的检出限分别为1pg/μl和1 ng/μl,浊度速率峰值均值分别为0.194、0.120,加钙黄绿素后出现浊度时间较未加钙黄绿素平均延迟23.6 min.LAMP法和qPCR法检测发热患者血样67份的结果一致,均检出相同的2份阳性,2份阳性血样对应的骨髓涂片镜检均查见利什曼原虫无鞭毛体.本研究建立的了检测利什曼原虫的LAMP法操作简便、灵敏度和特异性均较高,检测结果可视,具有较好的推广应用价值.

目的 利用可视化和实时荧光环介导等温扩增(LAMP)技术,建立日本红菇的快速鉴别方法.方法 基于日本红菇内转录间隔区的基因序列设计了特异性的LAMP引物,在23种蘑菇物种间进行特异性验证,通过检测10ng/μL～1 fg/μL系列浓度的基因组DNA,评估方法的灵敏度.结果 设计的LAMP引物可特异性鉴别日本红菇,不与其他蘑菇种类发生交叉反应.建立的LAMP方法检测灵敏度为1％混合蘑菇样本,或终浓度为2pg/μL的日本红菇DNA.结论 本方法可用于新鲜/干制蘑菇及烹饪后蘑菇的检测,检测时间＜1 h,其中可视化方法无需专业仪器设备,适用于日本红菇的现场快速鉴别.

[目的]明确南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus生物学特性及实现对该虫的可视化检测.[方法]室内观察记录南洋臀纹粉蚧不同发育阶段的形态特征和历期及雌成虫的繁殖能力;以南洋臀纹粉蚧28S rDNA序列为靶标,设计其特异性的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物组用于建立相应的可视化检测方法,并进行特异性、灵敏度及稳定性验证.[结果]南洋臀纹粉蚧雌雄虫具有不同的世代生活史,卵初产时即可见虫体轮廓,并具1对暗红色单眼;1龄若虫行动活泼,雌雄难辨;2龄若虫体缘出现白色细蜡棒,雌雄体型出现分化;3龄若虫仅存在雌虫,形似雌成虫;蛹仅存在雄虫,分为预蛹期和蛹期;雌成虫体表覆盖厚实的白色蜡粉,体缘18对粗蜡棒突出明显;雄成虫有一对透明发达的前翅,腹部末端具1对白色长蜡丝.该虫卵历期(1.37±0.26)h,雌成虫历期(32.67±4.82)d,各龄若虫、蛹和雄成虫历期均不超过(7.65± 0.82)d;两性生殖的单雌产卵量和卵孵化率分别为(531.92±69.98)粒和96.02％±1.35％,孤雌生殖的单雌产卵量和卵孵化率分别为(403.50±71.11)粒和88.41％±3.03％.建立的LAMP可视化检测方法能有效扩增南洋臀纹粉蚧DNA,最佳反应温度和时间及最低检测浓度分别为66 ℃、55 min和100 fg/μL,反应产物呈绿色阳性,检出率达91.67％～100.00％,但无法扩增其他7种近缘种属粉蚧DNA,反应产物呈橙黄色阴性.[结论]南洋臀纹粉蚧雌雄二型,生长发育快,繁殖力强,急需作好其检测与监测工作;该虫的LAMP可视化检测方法便捷高效、特异性强、灵敏度高且稳定性好,有望用于非专业鉴定人员对该虫的现场快速、准确识别.

目的 探讨可视化诺如病毒(norovirus,NoV)G Ⅱ型逆转录环介导等温扩增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法在感染性腹泻疫情中的应用价值.方法 利用文献报道的可视化NoV G Ⅱ RT-LAMP检测方法和RT-PCR方法分别对151份感染性腹泻疫情相关标本(80份病例粪便、43份肛拭子、16份末稍水和12份桶装水)标本进行NoV检测;评价RT-LAMP法和RT-PCR方法的一致性.结果 RT-LAMP方法检出42份感染性腹泻疫情标本NoV G Ⅱ型RNA阳性,阳性率为27.81％;RT-PCR方法检出37份感染性腹泻疫情标本NoV G ⅡRNA阳性,阳性率为24.50％;2种方法的检测结果经统计学分析,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 可视化NoV G ⅡRT-LAMP方法可用于感染性腹泻疫情的NoV GⅡRNA筛查.

目的 建立基于颜色判定的适用于国境口岸简便、快速、灵敏和特异的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法检测人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)核酸.方法 通过序列比对,选择HCoV-OC43(GenBank号:KU131570)为参考株,根据其核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白基因保守区序列设计6条特异性引物,在65℃等温条件下扩增45 min.在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,以最终反应颜色变化作为结果判断标准.对病毒核酸依次倍比稀释以检验该方法的灵敏性;同时,对甲型、乙型流感病毒和其他HCoV进行检测,以检验该方法的特异性.结果 通过引物筛选最终选定了1组特异性引物,仅能与HCoV-OC43病毒核酸产生特异性反应并出现颜色改变,而与其他病毒均不能产生颜色变化,具有较高的特异性.与常规荧光定量RT-PCR法相比,该方法检测灵敏度达5.6拷贝/反应,灵敏度更高,且在短时间内达到对HCoV-OC43基因快速检测的目的.结论 建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-OC43病毒快速、灵敏、特异性检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力.

目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒18(HPV18)进行基因检测,建立一种快速、可视的HPV18核酸检测方法.方法 针对HPV18病毒特异性E6区设计LAMP检测引物,通过调整反应物浓度建立LAMP反应体系,用羟基萘酚蓝(HNB)染料对产物进行可视化判定.通过检测其他不同基因型别的病毒评估引物特异性,检测倍比稀释的临床标本确定其灵敏度,通过LAMP法检测临床标本验证其与PCR法的一致性.结果 利用LAMP方法检测到HPV18病毒E6引物的特异性好,恒温65℃条件下反应60 min即可较好完成检测.LAMP特异性好,灵敏度高,灵敏度为2.5×103拷贝/ml.LAMP可视化结果判定与PCR凝胶电泳结果相当,二者有较好的一致性(P＞0.05).结论 建立了HPV18病毒的LAMP快速、可视化检测方法,该法操作简便快捷,具有很好的开发应用前景.

目的 建立快速分型检测登革热病毒 (Dengue virus, DEN) 1型～3型的RT-LAMP方法.方法 设计特异性引物分别建立DEN-1型、DEN-2型和DEN-3型RT-LAMP方法, 利用DEN-1型、DEN-2型和DEN-3型RT-LAMP方法分别检测23份DEN (20份DEN-1、2份DEN-2和1份DEN-3) 和20份肝炎病毒 (10份HBV和10份HCV) 阳性血清标本, 评估各型DEN RT-LAMP方法的特异性和敏感度;RT-LAMP扩增结果通过肉眼、电泳和酶切来鉴定.结果 经过对23份DEN和20份肝炎病毒阳性血清标本的检测, DEN-1型、DEN-2型和DEN-3型RTLAMP方法只针对靶病毒出现阳性扩增结果, 结果可以通过肉眼和电泳进行判断, 酶切证实了DEN-1型、DEN-2型和DEN-3型RT-LAMP产物的特异性, DEN-1型、DEN-2型和DEN-3型RT-LAMP方法敏感度均为45 pg/反应管.结论 建立了可视化的DEN-1型、DEN-2型和DEN-3型RT-LAMP快速分型检测方法.

目的 应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立一种鼠痘病毒(ECTV)的可视化快速检测方法.方法 通过序列分析选择3段ECTV序列保守区域设计了9套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320C仪监测反应进程并筛选最佳引物组合,优化反应条件,建立了对ECTV核酸进行特异性扩增的LAMP检测方法,并可通过加入目测荧光检测试剂肉眼判断结果.对所建立的方法进行了敏感性、特异性评估,并对人工感染样品进行了检测.结果 该方法在63℃恒温下作用60 min,ECTV DNA获得了高效特异性扩增,与其余常见小鼠病毒无交叉反应;最低检出量为530 fg/μL,是常规PCR的103倍,加入目测荧光染料判断结果与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致.结论 建立的ECTV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏和操作简单的特点,或具有良好应用前景.

目的 建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测B族链球菌(GBS)的方法并探讨此方法在临床诊断中的应用价值.方法 培养GBS,提取病原体DNA,设计GBS 16S-23S rRNA基因间隔区LAMP引物,优化并建立LAMP检测GBS的方法.分析LAMP法检测GBS DNA灵敏度,并与聚合酶链反应(PCR)法进行对比.分析LAMP法检测GBS DNA的特异度.结果 LAMP法可在1h内实现GBS DNA的可视化检测,检测限为20 fg,灵敏度高于PCR法(200 fg).LAMP法检测50例经PCR法确诊的GBS感染的临床样本,结果均为阳性,凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、淋病奈瑟菌、白色念珠菌的检测结果均为阴性.结论 LAMP检测GBS快速、简便、灵敏高且特异度强,检测不需任何设备,借助荧光笔肉眼直接判读,有望成为社区及基层医院广泛开展的新方法.