目的 利用可视化和实时荧光环介导等温扩增(LAMP)技术,建立日本红菇的快速鉴别方法.方法 基于日本红菇内转录间隔区的基因序列设计了特异性的LAMP引物,在23种蘑菇物种间进行特异性验证,通过检测10ng/μL～1 fg/μL系列浓度的基因组DNA,评估方法的灵敏度.结果 设计的LAMP引物可特异性鉴别日本红菇,不与其他蘑菇种类发生交叉反应.建立的LAMP方法检测灵敏度为1％混合蘑菇样本,或终浓度为2pg/μL的日本红菇DNA.结论 本方法可用于新鲜/干制蘑菇及烹饪后蘑菇的检测,检测时间＜1 h,其中可视化方法无需专业仪器设备,适用于日本红菇的现场快速鉴别.

目的 建立荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测化脓性链球菌毒力基因sdaB的方法.方法 根据GenBank公布的化脓性链球菌sdaB基因保守序列(GenBank:69901515),使用引物设计软件Primer Explorer V5.0获得LAMP引物.在LAMP体系中加入荧光染料,对引物、MgSO4、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate,dNTP)、Bst DNA 聚合酶的使用浓度进行了筛选,MgSO4浓度范围为 0～12 mmol/L、甜菜碱浓度范围为0～2.4 mol/L、dNTP浓度范围为0.2～2 μmol/L、上游内部引物(forward inner primer,FIP)和下游内部引物(backward inner primer,BIP)浓度范围为 0.2～2 μmol/L、上游外部引 物(forward outer primer,F3)和下游外部引物(back-ward outer primer,B3)浓度范围为0.2～0.4 μmol/L、Bst DNA聚合酶浓度范围为0.16～0.96 U/μL、荧光染料浓度范围为0.2～2 pmol/L.以优化后体系,在ABI7500实时荧光定量PCR分析仪上评估方法学特异性和最低检出限,检测了13种标准菌株包括A群链球菌、B群链球菌、C群链球菌、G群链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、淋病奈瑟菌、嗜酸乳杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌,最后检测了103例临床样本.结果 反应体系以25 μL 为宜,包含 25 μmol/L荧光染料 0.8 μL、100 mmol/L MgSO41 μL、5 mol/L甜菜碱 6 pL、25 mmol/L dNTP 1.4 μL、20 μmol/L FIP和BIP各2μL、20 μmol/L F3和B3各0.5 μL、8 U/μL Bst DNA聚合酶1μL 和2μL模板,去离子水补足,63℃反应45 min即可完成;最低检出限为500 pg/μL;检测12株非化脓性链球菌株,均为阴性结果.103例临床样本结果与培养法比较,临床灵敏度为100.0％(16/16),特异性为96.6％(84/87).结论 本研究检测化脓性链球菌的特异性和灵敏度较好,且操作简单,能满足临床需求,适宜现场检测及基层推广.

目的 结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性.方法 根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定.通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限.结果 恒温63℃条件下,20～60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA(含大量假单胞菌属细菌)呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为102 CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达101 copies/μL,比普通LAMP技术的灵敏度高10倍;人工污染土壤模拟样本RealAmp的检出限为4.4×101 CFU/g,且20 min左右即可判定结果;直接检测24份浓度为4.4×101 CFU/g～4.4×108 CFU/g的类鼻疽伯克霍尔德菌人工污染土壤样本,在检出限以上,检出率同荧光定量PCR一致.结论 该方法特异性强、灵敏度高,且可实时监测类鼻疽伯克霍尔德菌,有望成为快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的有效方法,增强抵御生物恐怖战争的能力.

目的 建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体.方法 在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果 .以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ 染料LAMP法检测,比较2种方法 的检出限.肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法 灵敏度.以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法 特异性.采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法 检出率差异.结果 实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号.SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色.实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增.实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05).结论 实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用.

目的 建立用于人乳头瘤病毒HPV16及HPV18快速检测的实时荧光环介导等温扩增技术. 方法 运用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V5,针对HPV16、18基因保守序列设计扩增引物,在反应前加入核酸染料SYBR GreenⅠ并对LAMP反应体系中内引物、Mg2+、dNTPs进行优化,优化结果通过实时荧光扩增曲线确定;然后对优化的HPV16、18 LAMP反应体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测. 结果 建立的实时荧光环介导等温扩增体系检测HPV16及HPV18的特异性为100％,与qPCR方法的符合率为100％.该体系检测HPV16及HPV18质粒的灵敏度为10拷贝/μl. 结论 建立的实时荧光环介导等温扩增体系检测HPV16、18简便、快速,灵敏度高,可用于HPV感染的早期筛查.

目的 建立一种准确、快速地检测三七Panax notoginseng根腐病病原真菌茄腐镰刀菌Fusarium solani的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法.方法 基于茄腐镰刀菌的氨基己二酸还原酶(Lys2)基因设计了qRT-PCR的特异性引物对Fs-QF和Fs-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了茄腐镰刀菌的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法和实时荧光环介导恒温扩增技术(LAMP)体系.从三七种植区采集到15个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用建立的检测方法进行检测.结果 建立的qRT-PCR检测方法和实时荧光环介导恒温扩增技术特异性强,能快速检测到携带茄腐镰刀菌的三七根腐病病株.此外,该方法灵敏度高,检测模板质量浓度可低至0.2 pg/μL.结论 建立的方法能明确三七种植土壤以及三七病株中茄腐镰刀菌数量的动态变化.可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及为带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持.

目的 建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病58型基因检测体系,用于其快速检测和早期诊断.方法 运用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V5,针对人乳头瘤病毒58型的L1区域保守基因设计引物,在反应前加入荧光核酸染料SYBR Green Ⅰ,并对该反应体系中的dNTPs、Mg2+和内引物(FIP、BIP)浓度进行优化,优化结果通过"S"型扩增曲线判断,并对优化后的实时荧光环介导等温扩增体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测.结果 针对人乳头瘤病毒58型所建立的实时荧光环介导等温扩增检测体系具有良好的特异性及灵敏度,且与临床实验室检测结果(qPCR方法)的符合率达100％,该检测方法的灵敏度可达10拷贝/μL.结论 本研究建立了人乳头瘤病毒58型的实时荧光环介导等温扩增检测体系,它是一种耗时少、操作简便、特异性强、灵敏度高的方法,适用于HPV临床样本的快速检测.

目的 建立实时荧光环介导恒温扩增(Rea-LAMP)快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法.方法 针对葡萄球菌的mecA耐药标志性基因和SA特有的femA基因的6个区域设计6条特异性引物,对MRSA、MSSA以及其他菌株等19株标准菌株的全基因组DNA进行Rea-LAMP,评价这些标准菌株的特异性、灵敏度和重复性;根据这些标准菌株的特异性,用Rea-LAMP反应体系检测临床分离的68株金黄色葡萄球菌(SA)菌株,并与VITEK2 Compact全自动微生物分析仪鉴定结果进行比较.结果 本研究体系的引物扩增效果好,无引物二聚体,在19株标准菌株的检测中,除了MRSA和MSSA有相应的反应曲线外,其余菌株均为阴性;本体系的灵敏度可达1μg/L,68株临床SA菌株检测结果与VITEK2 Compact全自动微生物分析仪鉴定结果一致.结论 Rea-LAMP反应体系检测MRSA特异性强、稳定性好、灵敏度高、操作简单快捷,可用于MRSA的快速检测.