目的:通过降低斑马鱼接触蛋白相关蛋白基因2（contact protein-related protein gene 2, cntnap2）表达，建立注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）遗传模型。方法:以注射剪接抑制型吗啉代寡聚核糖核酸降低cntnap2表达的斑马鱼作为实验组（ n=48），注射随机寡核苷酸片段的斑马鱼作为对照组（ n=48)，通过原位杂交观察斑马鱼神经递质系统相关基因th、dbh、gad1b、glyt2、vglut2表达的变化，使用实时荧光定量PCR检测神经递质系统及神经元发育相关基因表达量变化。使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统记录（Noldus行为仪）检测cntnap2表达降低后多动/冲动行为及托莫西汀对多动/冲动行为的改善作用。 结果:原位杂交实验结果显示实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达减少，gad1b表达增加；th、glyt2、vglut2表达未见明显差异。实时荧光定量PCR显示实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达降低（ t=5.772， P=0.005），snap25、dat、gad1b表达增高（ t=14.310、22.210、22.090,均 P<0.01）；神经元发育相关基因shha、epha4b、netrin1b、noi及神经递质系统相关基因drd4、th、vglut2、glyt2表达差异均无统计学意义。6 dpf时药物未处理实验组较药物未处理对照组幼鱼游动总距离长 ［143.12(98.56, 212.22) cm 与99.03(80.54, 133.96) cm， Z=-3.547， P<0.01］，平均游动速度快［0.050(0.041, 0.067) cm/s与0.033(0.025, 0.042) cm/s, Z=-5.495， P<0.01］；经托莫西汀处理后，实验组药物处理较药物未处理幼鱼游动总距离减少［106.59(95.28, 120.10) cm与143.12(98.56, 212.22) cm, Z=-3.591， P<0.01］，平均游动速度减慢［0.031(0.028, 0.037) cm/s与0.050(0.041, 0.067) cm/s， Z=-7.035， P<0.01］。 结论:cntnap2表达降低斑马鱼可通过改变dbh、snap25、dat、gad1b表达量而产生多动/冲动表型，托莫西汀可有效缓解多动/冲动表型，cntnap2表达降低斑马鱼可作为ADHD遗传模型。

目的:探究刺平面细胞极性蛋白1（prickle planar cell polarity protein 1，PRICKLE1）基因变异参与骨性Ⅲ类错 畸形发生的分子机制。 方法:收集2021年10月于南京医科大学附属口腔医院正畸科就诊的骨性Ⅲ类错 畸形伴上颌骨发育不足家系1个，提取该家系成员基因组DNA进行全外显子组测序，筛选致病基因及突变位点，Sanger测序验证突变序列。收集2021年10月至2022年12月于南京医科大学附属口腔医院口腔颌面外科就诊的正颌患者手术过程中切除的颌骨组织，提取并培养人颌骨骨髓间充质干细胞，转染过表达慢病毒（过表达目的基因的慢病毒为野生组，过表达突变位点的慢病毒为突变组）和敲降慢病毒（分为敲降1组和2组，以干扰阴性慢病毒为对照组），开展实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）实验、蛋白质印迹法实验、增殖实验、Transwell实验、碱性磷酸酶和茜素红染色。构建斑马鱼模型，注射吗啉代寡聚核苷酸（morpholino oligonucleotide，MO），在斑马鱼体内敲低prickle1a和prickle1b的表达（共敲组），对照组注射标准化MO作为参照。对2组斑马鱼颅面部组织进行转录组测序、富集分析和共表达分析。 结果:该家系2例患者均携带PRICKLE1 c.113C>T突变。转染实验显示，相比野生组（PRICKLE1相对表达量为21.97±0.60），突变组人颌骨骨髓间充质干细胞PRICKLE1相对表达量（5.05±0.05）显著降低（ P<0.05），细胞增殖能力和迁移能力显著增强（ P<0.05），成骨分化能力显著减弱（ P<0.05）；相比对照组，2个敲降组细胞的增殖能力和迁移能力均显著增强（ P<0.05），成骨分化能力均显著减弱（ P<0.05）。斑马鱼模型实验显示，与对照组（338.80±24.92）相比，共敲组斑马鱼筛板宽度显著减小（282.50±61.77）（ t=5.29， P<0.001）。转录组测序富集分析结果显示，共敲组和对照组的差异基因在丝裂原活化蛋白激酶信号通路上富集明显。 结论:PRICKLE1 c.113C>T突变下调丝裂原活化蛋白激酶信号通路，抑制颌骨骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，进而参与骨性Ⅲ类错 畸形的发生发展。

目的:构建斑马鱼脑出血模型，并以此筛选诱导斑马鱼脑出血的相关基因。方法:通过吗啉代寡核苷酸（MO）技术和单细胞显微注射技术构建斑马鱼脑出血模型，并从宏观、微观角度多重验证。首先，造模实验采用注射Control MO的正常野生型AB品系斑马鱼作为对照组，实验组在AB斑马鱼胚胎单细胞时期分别注射神经嵴源性细胞（NCDCs）发育相关基因的MO，包括col8a1 MO、tfap2α MO、msx1a MO、msx2 MO、dkk1a MO等，于显微镜白光视野下初步验证模型。其次，采用Tg（flk1：GFP；gata1：dsRed）双转基因斑马鱼进行模型验证，该转基因鱼用绿色荧光蛋白（GFP）标记血管内皮细胞，用红色荧光蛋白（dsRed）标记血红细胞，能够更清晰地观察到斑马鱼脑出血的部位。在斑马鱼胚胎单细胞时期注射Control MO 作为对照组，注射col8a1 MO作为实验组，正常培养至受精后48 h通过激光共聚焦观察红细胞渗漏情况，构建荧光视野可观察的脑出血模型。最后，采用Tg（flk1：GFP）转基因斑马鱼进行基于血脑屏障的模型验证，通过Dextran-Rhodamin和DAPI染料的渗漏现象进一步明确斑马鱼血脑屏障的破坏与脑出血的发生，并进行定量统计，从而验证NCDCs发育相关基因与脑出血表型的关系，证明造模有效。结果:与注射Control MO的正常野生型AB品系斑马鱼对照组相比，col8a1、tfap2α和msx1基因突变的实验组斑马鱼有明显的脑出血现象，出血比例分别为18.18%（52/286）、23.04%（62/251）、35.94%（23/64），而msx2和dkk1a基因突变的斑马鱼极少观察到脑出血，出血比例仅分别为1.03%（1/97）和1.15%（1/87）。注射Control MO与col8a1 MO的Tg（flk1：GFP；gata1：dsRed）双转基因斑马鱼红细胞渗漏发生率分别为0.37%（1/273）与18.18%（52/286）（ P<0.001）。注射Control MO与col8a1 MO组Tg（flk1：GFP）转基因斑马鱼DAPI阳性的细胞核数分别为（10.05±5.27）个与（60.35±3.96）个（ P<0.001）；Dextran-Rhodamin染料渗漏引起的中脑实质荧光示踪强度值分别为2.54±4.70与5.13±3.52（ P<0.001），两组比较差异有统计学意义。 结论:本研究成功构建了斑马鱼脑出血模型，并筛选出col8a1、tfap2α、msx1等诱导斑马鱼脑出血的相关基因。

目的:探讨nicastrin（nct）基因对斑马鱼黑素细胞生物学功能的影响。方法:利用吗啉代寡核苷酸（MO）技术针对斑马鱼nct基因mRNA设计nct-MO序列，同时设计对照MO序列（ctrl-MO），并构建5′端为MO靶序列的增强绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA，通过显微注射的方式将nct-MO或ctrl-MO与EGFP mRNA共注射入斑马鱼胚胎中，验证nct-MO的沉默效率，观察其表型变化。以野生型斑马鱼作为空白对照组，实时荧光定量PCR检测黑素合成notch信号通路相关基因mitfa、tyr、tyrp1a、tyrp1b、dct、pmela、notch1a、notch1b、hey1 mRNA表达水平的变化。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:斑马鱼受精后8 h，ctrl-MO+EGFP mRNA组斑马鱼胚胎中均有绿色荧光表达，而nct-MO+EGFP mRNA组及空白对照组胚胎均未见绿色荧光。受精后48 h，nct-MO组幼鱼尾部色素沉着区面积占比（0.169 ± 0.083）低于ctrl-MO组（0.258 ± 0.042， t=3.202， P=0.005），且nct-MO组色素分布紊乱。实时荧光定量PCR显示，nct-MO组、ctrl-MO组、空白对照组间pmela、tyrp1a、hey1基因mRNA相对表达量差异有统计学意义（均 P < 0.05），mitfa、tyr、tyrp1b、dct、notch1a、notch1b mRNA相对表达差异无统计学意义（均 P > 0.05）；nct-MO组pmela、tyrp1a相对表达水平（0.708 ± 0.028、0.558 ± 0.136）低于ctrl-MO组（1.023 ± 0.142、1.016 ± 0.134，均 P < 0.05）。 结论:nct基因可能通过调控斑马鱼黑素合成影响黑素细胞生物学功能。

目的 探索与优化磷酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)关键中间产物7'-羟基-N-三苯甲基吗啉代核苷单体合成工艺路线和方法,使其合成更加高效与便捷,为以PMO为结构基础的反义寡核苷酸类药物研究奠定基础.方法 以N4-苯甲酰基胞苷,鸟苷与5-甲基尿苷作为起始原料,经过将核糖环结构改造为吗啉环并对关键化学基团保护等步骤合成7'-羟基-N-三苯甲基吗啉代核苷单体.结果 分别得到N4-苯甲酰基-7'-羟基-N-三苯甲基吗啉代胞苷、N2-苯甲酰基-7'-羟基-N-三苯甲基吗啉代鸟苷和7'-羟基-N-三苯甲基吗啉代胸苷,并对三者合成的工艺方法进行了优化,对所合成的中间体和目标物进行了结构确证.结论优化后的7'-羟基-N-三苯甲基吗啉代核苷单体合成工艺高效、便捷且适合放大制备.

目的 探讨利用吗啉代寡核苷酸技术(MO)下调lmna后斑马鱼胚胎细胞的凋亡机制.方法 在目的基因lmna序列中选择靶点,设计针对目的基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),利用显微注射技术,将lmna-MO注射到野生型斑马鱼(Tüebingen品系)胚胎中,下调斑马鱼lmna基因.采用流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡蛋白p-AKT、AKT及BCL-2的表达量.结果 注射lmna-MO后24和72 h,斑马鱼胚胎均存在细胞早期凋亡,且与药物暴露时相存在相关性(P<0.01);lmna-MO注射后24和72 h,p-AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P<0.01);AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P<0.05);而BCL-2蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有下降(P<0.05).结论 lmna基因参与调控斑马鱼胚胎细胞凋亡过程,其机制可能与AKT蛋白及BCL-2蛋白的表达有关;p-AKT(S473)参与AKT通路活化,而lmna基因下调可促进AKT磷酸化,通过活化P13K/AKT信号通路来抑制凋亡促进细胞存活,但其并非唯一凋亡调控机制.

目的:探讨KLF7b对斑马鱼胚胎发育的影响.方法:体外转录野生型KLF7b m RNA、KLF7b乙酰化位点突变体m RNA;设计合成特异性KLF7b反义吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonueleitide,MO);在1～2细胞期注射到斑马鱼胚胎体内以实现KLF7b的过表达、位点突变与敲降;观察胚胎表型并利用定量PCR检测发育相关基因的表达变化,钙黄绿素染色观察斑马鱼骨骼发育情况.结果:过表达KLF7b对斑马鱼胚胎的发育无明显影响;敲降KLF7b或注射乙酰化位点突变的KLF7b后,斑马鱼胚胎出现心包积液、体轴和头部发育的异常,肌肉发育标志基因表达下调.结论:KLF7b可通过乙酰化修饰影响斑马鱼的发育.

目的 通过显微注射吗啉环反义寡核苷酸(morpholino oligo,MO),使斑马鱼骨形态发生蛋白2a(bone morphgenetic protein 2a,BMP2a)基因敲降,观察BMP2a基因表达抑制后对斑马鱼骨代谢的影响.方法以受精后半小时斑马鱼受精卵为模型,将MO显微注射到受精卵(20个,对照组相同处理),对注射MO后及野生型(wild type,WT)的幼鱼于第9天分别进行茜素红染色,比较硬骨的形态差异,同时运用ImageJ软件对染色体积进行统计,比较差异.对注射MO后的幼鱼于第4天提取的cDNA采用实时荧光定量PCR(QPCR)方法检测Runx2a、Runx2b、Sp7、Alp骨形成相关基因和WT基因组的成骨下游基因表达的差异.对注射MO后第4天的斑马鱼予以成骨代表性的两个基因Runx2a进行原位杂交,比较WT幼鱼相关成骨基因表达部位的差异和信号强弱.结果与WT染色相比,注射抑制BMP2a的MO后第9天斑马鱼硬骨茜素红染色变浅,体积更小(MO vs.WT:3276±153 vs.4768±231,P<0.05).QPCR检测显示,注射MO后第4天的斑马鱼成骨代谢基因表达量与WT斑马鱼对应基因相比均下调(Runx2a:0.348±0.002 vs.1.007±0.032;Runx2b:0.525±0.021 vs.1.013±0.021;Sp7:0.483±0.026 vs.1.124±0.173;Alp:0.136±0.012 vs.1.233±0.237;P<0.05).就Runx2a原位杂交而言,注射MO后第4天斑马鱼信号表达弱于同期WT斑马鱼.结论通过基因敲降技术使得斑马鱼BMP2下调,直观地观察到斑马鱼的骨发育迟缓,运用分子手段发现其基因下调造成一系列的成骨基因降低,用原位半定量方法靶向定位到斑马鱼蝶骨上,基因下调后造成斑马鱼的蝶骨信号消失.

磷酰二胺吗啡啉寡核苷酸(吗啉代寡核苷酸,PMO)是一类功能强大的合成寡核苷酸类似物,在核酸药物发展史上属于第3代反义寡核苷酸.PMO的电中性吗啡啉结构使其具有结合亲和性高和抗酶解稳定性强的特点,通过序列特异性结合靶RNA,达到抑制RNA翻译和干扰RNA加工的效果,已成功应用于核酸药物的研发和基因功能的研究.本文简要综述了PMO作为治疗药物和RNA研究工具的进展、挑战和前景,及其进一步的结构修饰优化.

Golodirsen是由Sarepta Therapeutics公司研发的一种磷酰二胺吗啉代寡聚体(PMO)亚类反义寡核苷酸,于2019年12月12日经美国FDA批准上市,其商品名为Vyondys 53.FDA在审批golodirsen时采用了快速审批及优先评审程序,并授予其孤儿药地位.Golodirsen通过靶向抗肌萎缩蛋白(dystrophin)而发挥作用,用于已确诊为发生外显子53跳跃基因突变患者的杜氏肌营养不良症(DMD)的治疗[1].