目的:了解云南省家畜阿卡斑病毒(akabane virus, AKAV)的流行情况。方法:2015年4月在云南省芒市设立5只山羊和10头黄牛作为哨兵动物进行家畜虫媒病毒监测，5～10月份每周采集动物血液，标本经实验室处理后接种BHK-21细胞进行病毒分离，对病毒分离物进行病毒基因(RT-PCR)扩增、核苷酸序测定及分析。结果:1只哨兵山羊血液样品接种BHK-21细胞48 h后产生明显细胞病变，取细胞培养物上清液脑内接种1日龄乳鼠，3 d后乳鼠开始发病死亡，经RT-PCR鉴定和S片段基因序列测定分析，分离毒株为AKAV(毒株编号16415)。16415毒株S片段基因全长856nt，编码N蛋白233aa和Ns蛋白91aa，遗传进化分析结果显示新分离16415毒株与国内外分离的AKAV位于同一进化分支内，核苷酸同源性在83.8%～97.7%之间；进一步分析发现16415株与广西2013年从竹鼠脑内分离到的AKAV亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸同源性分别为97.7%、99.6%；与日本AKAV OBE-1毒株相比，16415株、广西竹鼠分离毒株和德宏迷糊按蚊分离毒株在N蛋白上存在2个共同的差异位点，分别是N115位和N206位。结论:在云南省芒市地区设置的哨兵山羊血液标本分离到AKAV，具有重要的流行病学意义。

实验动物微生物质量对科学研究数据的有效性和重复性以及人类健康和动物福利至关重要.目前,独立通风笼具(individual ventilation cage,IVC)已成为主流的啮齿类实验动物饲养系统.针对这种饲养方式的病原体监测方法最常用的是脏垫料哨兵动物法(soiled bedding sentinels,SBS),该方法是以间接接触和延迟反馈的方式监测鼠群的微生物携带状况,能有效监测通过粪-口途径传播的病原体如小鼠肝炎病毒、呼肠孤病毒等.但这种方法难以监测到主要通过气溶胶、直接接触等途径传播的病原体,例如仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌等.排风粉尘(exhaust air dust,EAD)-PCR监测方法分为在IVC笼架排风管道中拭子采样,用以监测管道相对应的笼架;主机初效过滤前拭子采样,用以监测整个IVC笼架;EAD收集装置采样,用以监测同一个主机连接的所有笼架.不同IVC厂商针对各自的IVC系统开发了相应的EAD收集装置,使操作便捷,容易实现标准化.目前,与SBS方法相比,EAD-PCR方法的检出率和时效性都有显著提升,最快暴露一周就可检出,可作为SBS方法的补充或替代,有利于维护实验动物福利.本文对上述两种病原体监测方法的应用进展进行综述,同时结合本实验室和送检单位EAD-PCR监测的实施情况,对该方法存在的局限性进行分析并提出解决方案.EAD-PCR方法有助于减少活体哨兵动物的使用量,可以更好地维护实验动物福利的"3Rs"原则.

我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道.为了解云南省EHDV的流行情况,2012～2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监控动物血液,接种幼仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)进行病毒分离;通过PCR检测、血清中和试验、琼脂糖凝胶电泳和电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定;对分离毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3基因节段进行克隆、测序与序列分析.2013年在云南省师宗县的哨兵牛上分离出一株EHDV毒株(YNSZ-V277-2013),病毒可引起BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(Cytopathic effect,CPE);电镜下病毒粒子呈球形,无囊膜,表面有大量纤维突,直径在70～80nm之间;病毒基因组dsRNA的琼脂糖凝胶电泳显示分离毒株与其他血清型EHDV一致,呈现“3-3-3”的电泳带型;序列分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3序列与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)相似度最高,分别为97.5％/98.5％与98.1％/99.8％,证实分离毒株为EHDV-10型;系统发育分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)的亲缘关系最近,Seg-3与分离至日本和澳大利亚的EHDV毒株同属Eastern型.本研究首次报道了EHDV-10型毒株在我国的分离以及分离毒株的Seg-2与Seg-3基因序列特征,为进一步开展中国EHDV-10型的流行病学调查与致病性研究提供了基础.

目的 以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计.方法 用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20)28 d,进行脏垫料接触感染.之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析.结果 对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20％),第28天阳性检出率达到最高,为80％,第42天阳性检出率为50％,至第56天无阳性检出.血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50％).对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20％小鼠粪便中检出MHV.而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体.结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠.由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法.

目的 研究独立通风笼具换笼标准操作程序与实验动物负压屏障设施内使用IVC(individual ventilated cage,IVC)设备饲养小鼠的病毒感染风险.方法 选择小鼠易感的小鼠肝炎病毒(MHV)A59株感染6周龄BALB/c雄性小鼠,按照IVC换笼标准操作程序进行换笼操作;使用IFA和ELISA血清学方法以及针对MHV的核酸检测方法测定同一笼架具相邻笼盒、同一IVC系统不同笼架具的不同位置、以及IVC系统外负压屏障设施内哨兵动物的MHV感染情况.结果 接种病毒小鼠在感染6 d后出现临床症状,粪便中可检出MHV病原;动物感染3周后可检出MHV抗体阳性;其他监测组在5周实验终点均无MHV阳性检出.结论 IVC换笼标准操作程序可指导IVC换笼操作,用以控制病毒类病原对小鼠的感染风险.

目的 实验动物质量直接关系着研究和评价数据的准确性和可重复性,亦是公共卫生安全的主要部分.方法 针对高校动物中心来源复杂、人员流动性大、需求多样等特点,从管理体系建立和病原检测角度提升实验动物质量.结果 建立并执行了实验动物准入制度、哨兵动物监测制度、动物用品监测制度等系列管理体系,自2018年以来,检测了1481批次非活体动物样本,106批次病原阳性,检测了395例活体动物样本,38例病原阳性,检测了363份动物相关用品.结论 禁止了数批烈性传染病病原阳性动物的进入、严密监视了条件致病菌阳性动物的来源单位、及时调整和更新了大小鼠监测病原谱,从而提升了实验动物质量.