目的:探讨橙皮素对膀胱肿瘤细胞T24细胞株生长繁殖的影响，探讨橙皮素的相关作用机制。方法:体外培养购自美国模式培养无集存库人膀胱肿瘤T24细胞株，将2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μmol/L橙皮素分别作用于T24细胞株24、48、72 h并通过噻唑蓝(MTT)法观察细胞生长和增殖状况；通过流式细胞仪检测细胞生长G 0期与G 1比值百分比的变化；并通过Transwell实验观察橙皮素对T24细胞迁移和侵袭的影响；蛋白质印迹法(Western blot)观察磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、细胞外信号调节激酶(ERK) 、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达及与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)比值的变化。两组之间的比较使用独立样本 t检验，多组间比较使用单因素方差分析。 结果:橙皮素可明显抑制T24细胞株的增殖，且经橙皮素处理24 h组的半抑制浓度(IC 50)[(20.79±1.82) μmol/L]与处理48 h组的IC 50[(21.34±1.64) μmol/L]相当，两者差异无统计学意义( t＝0.562， P>0.05)，而两组高于72 h组(10.28±1.16) μmol/L，有统计学意义( t＝10.498、11.060， P<0.05)；10、20 μmol/L组作用48 h后细胞周期G 0/G 1百分比分别为(70.12±5.21)%、(78.46±7.43)%，高于对照组[(57.86±5.39)%]，差异有统计学意义( t＝12.260、20.600， P<0.05)；10 、20 μmol/L组作用48 h后侵袭抑制率分别为(25.37±1.76)%、(41.31±1.86)%，迁移的抑制率分别为(21.23±1.09)%、(34.67±1.58)%，高于对照组侵袭抑制率[(0.21±0.02)%]和迁移抑制率[(0.27±0.03)%]，差异有统计学意义( t＝25.170、41.110； t＝21.030、34.470， P<0.05)；10 、20 μmol/L组作用48 h后p-ERK、PI3K、p-Akt、N-Cadherin蛋白表达降低，与内参的比值分别为(0.46±0.06、0.44±0.06；0.54±0.08、0.51±0.09；0.48±0.06、0.47±0.07；0.50±0.05、0.49±0.05)比对照组与内参比值(0.67±0.06、0.82±0.11、0.71±0.04、0.78±0.10)低，差异有统计学意义( t＝4.205、4.283、4.231、5.278； t＝4.231、4.310、4.240、5.281， P<0.05)，E-Cadherin蛋白表达升高，与内参的比值分别为(0.73±0.14、0.74±0.20)比对照组与内参比值(0.56±0.08)高，差异有统计学意义( t＝7.181、7.183， P<0.05)。 结论:橙皮素对膀胱癌T24细胞株生长有抑制作用，其机制可能与PI3K/Akt和RAS/MAPK信号通路有关。

目的 建立基于荧光染料噻唑橙和核酸适配体45e-1的非标记型适配体传感器,以快速、灵敏地检测石房蛤毒素(STX).方法 将50 nmol/L 45e-1溶解在缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl,pH=7.5)中,在95℃水浴中加热10 min,冰水浴中冷却5 min.随后加入STX标准溶液,充分混匀,室温孵育10 min后.再加入噻唑橙溶液,添加缓冲液使反应体系体积为100μL,充分混合后室温孵育2 min.最后在496 nm激发波长下测定体系的荧光强度.结果 当噻唑橙与45e-1的摩尔浓度比为5:1、噻唑橙与45e-1的孵育时间为2 min、STX与45e-1的孵育时间为10 min、Mg2+的浓度为2.5 mmol/L、K+的浓度为5 mmol/L时,反应体系的荧光强度与STX浓度呈良好的线性关系,拟合线性方程为Y=3639.8X+2341.5[R2=0.9725,X为STX浓度(nmol/L)的常用对数],检测限为0.67 nmol/L,对其他常见海洋毒素的交叉反应可以忽略.在海水中,该方法的回收率为90.7％～108.7％,RSD为7.1％～10.9％.结论 所建立的非标记型适配体传感器可以定量检测STX,具有良好的特异性和重现性.

目的 探讨淫羊藿苷对高糖诱导的足细胞自噬、凋亡及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)通路的影响.方法 将小鼠足细胞MPC5 分为 5 组:正常对照组(5.5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖组(30 mmol·L-1 葡萄糖)、淫羊藿苷组(30 mmol·L-1 葡萄糖+5 μmol·L-1 淫羊藿苷)、GDC-0349 组(30 mmol·L-1 葡萄糖+50 μmol·L-1 GDC-0349)、淫羊藿苷+GDC-0349 组(30 mmol·L-1 葡萄糖+ 5 μmol·L-1淫羊藿苷+50 μmol·L-1 GDC-0349).培养 48h后,噻唑蓝法检测MPC5 细胞活力;吖啶橙染色观察MPC5细胞自噬情况;流式细胞术检测MPC5 细胞凋亡;蛋白印迹法检测MPC5 细胞自噬[微管相关蛋白 1 轻链 3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、自噬相关蛋白(Beclin-1)]、凋亡[Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)]和mTOR/Akt/CREB通路相关蛋白的表达.结果 与正常对照组比较,高糖组MPC5 细胞活力、Bcl-2、磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR、磷酸化Akt(p-Akt)/Akt、磷酸化CREB(p-CREB)/CREB蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),自噬能力增强,自噬体表现出橙色荧光,细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax蛋白表达水平显著升高(P＜0.05).与高糖组比较,淫羊藿苷组MPC5 细胞活力、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表达水平显著升高,自噬能力进一步增强,自噬体数量增多,自噬体呈现出砖红色荧光(P＜0.05),细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著降低(P＜0.05);GDC-0349组MPC5 细胞活力、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表达水平显著降低,自噬能力减弱,自噬体数量减少,自噬体表现出橙色荧光(P＜0.05),细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著升高(P＜0.05);淫羊藿苷+GDC-0349 可逆转淫羊藿苷对高糖诱导 MPC5 细胞的作用效果(P＜0.05).结论 淫羊藿苷通过激活mTOR/Akt/CREB通路促进高糖诱导的足细胞自噬抑制细胞凋亡.

目的 探讨白藜芦醇通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路诱导白血病细胞自噬及凋亡的作用机制.方法 白血病细胞被分为对照组、白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组,分别用不同浓度的白藜芦醇处理(0、100、200 μmol/L).噻唑蓝(MTT)实验分别比较细胞 1、3、6、12、24、48 h增殖抑制率;通过吉姆萨染色法对细胞变化进行观察;流式细胞术实验比较其凋亡率及自噬率;吖啶橙染色法观察比较细胞自噬情况;Western印迹比较细胞p-AMPK、微管相关蛋白(LC3B)、p-mTOR、半胱氨酸天冬酶(Caspase)-3 蛋白表达情况.结果 经不同浓度白藜芦醇处理后的白血病细胞增殖抑制率较对照组明显升高(P<0.05),并且随作用时间增长其作用效果越强;经不同浓度白藜芦醇处理后的白血病细胞凋亡率及自噬率均较对照组明显升高(P<0.05);经不同浓度白藜芦醇处理后的白血病细胞内p-AMPK、LC3B含量均较对照组明显升高(P<0.05),而p-mTOR、Caspase-3 含量较对照组明显降低(P<0.05).结论 白藜芦醇对白血病细胞自噬及凋亡过程具有明显的促进作用,其具体作用与AMPK/mTOR有关.

目的:基于GC-MS分析,建立了石上柏挥发油的化学成分与其抑制人肺癌A459细胞株和肝癌7721细胞株的谱效关系模型,寻找与药效显著相关的活性成分.方法:采用噻唑蓝法(MTT)测定石上柏挥发油抑制人肺癌A459细胞和肝癌7721细胞活性,以半数抑制浓度(IC50)为评价指标;采用GC-MS分析,确定了11个特征峰;利用Simca-p11.5软件的正交投影偏最小二乘法(Orthogonal Partial least squares,OPLS)和SPSS 18.0软件的双变量相关分析(Bivariate),研究特征峰与药效的相关性,根据S-载荷图、变异权重参数值(variable importance in projection,VIP)和皮尔逊相关系数(Pearson)来辨识显著活性成分.结果:GC-MS分析石上柏共得到71个化合物,鉴定出其中64个化合物,其相对峰面积分别占总峰面积的98.19％.主要包括萜类,脂肪酸及其烃类化合物.不同产地石上柏挥发油对A549和7721细胞株具有一定的抑制作用,其中抑制A549细胞最高的IC50为46.81 mg·L-1 (S6);抑制7721细胞最高的IC50为34.02 mg·L-1 (S5).通过OPLS和Bivariate数据分析,发现5个挥发油成分,即芳樟醇、橙花叔醇、新植二烯、亚油酸甲酯、植酮,与石上柏挥发油抑制肺癌A549细胞和肝癌7721细胞活性显著相关.结论:该方法能快速、有效地建立石上柏挥发油谱效相关关系,可为石上柏挥发油化学成分药理性质的研究提供参考依据.

目的 探讨氯胺酮通过诱导B103细胞自噬产生抗帕金森病(Parkinson's disease,PD)的作用及分子机制.方法 以B103细胞为实验模型,分别以不同浓度氯胺酮(0、100、200、400μmol/L)及400μmol/L氯胺酮+5 mmol/L 3-methyladenine(3-MA)处理后,采用噻唑蓝[3-(4,5-dimenthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)]染色法检测细胞增殖率;应用吖啶橙与Lyso-Tracker Red染色,荧光显微镜检测细胞自噬;Western blot检测相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(microtubulesas sociated protein light,LC3)、 蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p70S6K、 雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、α-synuclein(α-syn)及β-synuclein(β-syn)蛋白的表达.结果 不同浓度氯胺酮作用于神经母细胞瘤B103细胞7 d后,MTT染色法检测结果显示,100、200、400μmol/L分别与0μmol/L比较,细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05);吖啶橙与Lyso-Tracker Red染色结果提示,随着氯胺酮浓度增加,自噬作用逐渐增强(P<0.05);Western blot结果显示,400μmol/L较0μmol/L自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、磷酸化(phospho,p)-Akt、p-p70S6K以及p-mTOR表达减少,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达增多(P<0.05);此外,400μmol/L较0μmol/L表达PD标志性蛋白α-syn减少而β-syn增多(P<0.05).自噬抑制剂(3-MA,5 mmol/L)预处理可逆转氯胺酮对B103细胞的上述作用(400μmol/L+3-MA与400μmol/L比较,P<0.05).结论 氯胺酮通过抑制Akt/mTOR信号转导通路诱导B103细胞自噬并降解α-syn从而产生抗PD的作用.

目的 探讨双氢青蒿素(DHA)对癌细胞和正常细胞的毒性差异,为将青蒿素类药物用于肿瘤的治疗提供实验依据.方法 以来源于肺组织的癌细胞A549和正常支气管上皮HBE细胞为研究对象,采用噻唑蓝比色(MTT)、集落形成、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染、蛋白浓度测定、乳酸脱氢酶(LDH)释放5种不同的细胞毒性实验观察DHA对2种细胞的毒性差异.结果 不同浓度的DHA处理24 h后,2种细胞存活率均显著降低,DHA对A549和HBE细胞的半数抑制浓度分别为61.55μmol/L和87.83 μmol/L.与自身对照组(0μmol/L DHA)相比,DHA(20和60 μmol/L)可以减少A549和HBE细胞的集落形成率、蛋白含量,同时增加细胞死亡率和LDH释放水平(P＜0.05),这些效应与DHA浓度具有一定相关性,且A549细胞的效应高于HBE细胞(P＜0.05).结论 DHA对来源于肺组织的癌细胞和正常细胞均有明显的细胞毒性,且以A549细胞敏感,这对DHA用于肿瘤的治疗具有积极的意义,但同时不能忽视DHA对正常细胞的毒副作用.

为了探明对星天牛Anoplophora chinensis有效的引诱物质,本实验研究了星天牛对其嗜好取食的砂糖橘Citrus reticulata cv.Shiyue Ju和苦楝Melia azedarach枝叶浸提物的触角电位反应(GC-EAD),结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析了寄主浸提物化学成分.结果表明:壬醛,α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇、4-松油烯醇、松油醇、苯并噻唑和石竹烯等8种寄主植物组分均能引起星天牛不同程度的触角电位反应,其中壬醛的GC-EAD反应重复性最好.本研究为星天牛引诱剂开发提供了理论依据.

目的:夹竹桃科(Apocynaceae)山橙属(Melodinus)植物在我国民间应用的历史悠久,其生物碱类化学成分具有抗肿瘤、抗菌、抗生育等生物活性.该文对夹竹桃科山橙属植物景东山橙(Melodinus Khasianus)中生物碱类化学成分进行系统研究.方法:运用硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱及高效液相制备色谱对景东山橙中生物碱类化学成分进行分离和纯化,并通过其理化性质及波谱数据确证生物碱类化合物的结构.通过噻唑蓝(MTT)比色法,对分离得到的化合物进行前列腺癌细胞(PC-3),肺癌细胞(A549),胃癌细胞(HGC-27)和人白血病细胞(HL-60)的细胞增殖抑制筛选.结果:从景东山橙乙醇提取物的三氯甲烷部位分离得到12个化合物,分别鉴定为(+ ) epi-16α-hydro-14, 15vincamine (1), 16β, 21β-epoxy-vincadine (2 ), melodinines G(3),melodinines P (4 ),melodinines N (5 ), 16β-hydroxy-19S-vindolinine (6), 16β-hydroxy-19R-vindolinine (7 ),15α-hydroxy-14,15-dihydrovindolinine(8),melodinines T(9),19-epimeloscandonine(10),门洛斯坎刀尼(11),攀援山橙碱(12).结论:其中化合物1～10为首次从景东山橙中分离得到的生物碱.采用MTT比色法对化合物进行体外抗肿瘤活性筛选,发现化合物4,5对前列腺癌细胞(PC-3),肺癌细胞(A549),胃癌细胞(HGC-27)和人白血病细胞(HL-60)等肿瘤细胞具有一定的细胞增殖抑制作用.

目的 研究青藤碱(SIN)对同种异体胰岛刺激淋巴细胞的免疫抑制作用以及对胰岛活性和功能的影响.方法 以Wistar大鼠胰岛作为刺激原,Lewis大鼠脾淋巴细胞作为反应细胞体外共同培养,分为4组:SIN组为SIN+胰岛+淋巴细胞共培养;他克莫司(Tac)组为Tac+胰岛+淋巴细胞共培养;阴性对照组为胰岛+淋巴细胞共培养;空白对照组为单纯淋巴细胞培养.四甲基噻唑蓝法检测各组淋巴细胞增殖情况,ELISA法检测上清液细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-10)浓度以及胰岛素分泌量,吖啶橙-碘化丙啶染色检测胰岛细胞活性.采用单因素方差分析比较4组混合淋巴细胞培养后OD值、细胞增殖率、上清液细胞因子浓度、胰岛素分泌量及胰岛素刺激指数等指标,采用LSD法进行组间两两比较.结果 混合淋巴细胞培养第3天,阴性对照组、SIN组、Tac组和空白对照组OD值分别为0.524±0.048、0.438±0.032、0.429±0.037、0.327±0.026;SIN组OD值低于阴性对照组、高于空白对照组,差异均有统计学意义(P均＜0.05),但与Tac组相比差异无统计学意义(P＞0.05).计算淋巴细胞增殖率SIN组和Tac组分别为(33.9±2.8)％、(33.2±3.0)％,均低于阴性对照组(P均＜0.05),但SIN组和Tac组差异无统计学意义(P＞0.05).SIN组上清液IFN-γ、IL-2浓度分别为(67±6)、(322 ±21) pg/mL,均低于阴性对照组,高于空白对照组(P均＜0.05),但与Tac组差异无统计学意义(P＞0.05);IL-10浓度为(76±4) pg/mL,高于其他3组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).SIN组高糖及低糖刺激下胰岛素分泌量分别为(14.7±2.1)、(8.3±1.2) mU/L,计算胰岛素刺激指数为1.73 ±0.24,胰岛细胞存活率为(82.5±4.7)％,均优于Tac组和阴性对照组(P均＜0.05).结论 SIN对同种异体胰岛刺激的淋巴细胞具有免疫抑制作用,同时可减轻胰岛免疫损伤;与他克莫司相比,能更好地保持胰岛细胞活性及分泌功能.