目的 建立基于荧光染料噻唑橙和核酸适配体45e-1的非标记型适配体传感器,以快速、灵敏地检测石房蛤毒素(STX).方法 将50 nmol/L 45e-1溶解在缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl,pH=7.5)中,在95℃水浴中加热10 min,冰水浴中冷却5 min.随后加入STX标准溶液,充分混匀,室温孵育10 min后.再加入噻唑橙溶液,添加缓冲液使反应体系体积为100μL,充分混合后室温孵育2 min.最后在496 nm激发波长下测定体系的荧光强度.结果 当噻唑橙与45e-1的摩尔浓度比为5:1、噻唑橙与45e-1的孵育时间为2 min、STX与45e-1的孵育时间为10 min、Mg2+的浓度为2.5 mmol/L、K+的浓度为5 mmol/L时,反应体系的荧光强度与STX浓度呈良好的线性关系,拟合线性方程为Y=3639.8X+2341.5[R2=0.9725,X为STX浓度(nmol/L)的常用对数],检测限为0.67 nmol/L,对其他常见海洋毒素的交叉反应可以忽略.在海水中,该方法的回收率为90.7％～108.7％,RSD为7.1％～10.9％.结论 所建立的非标记型适配体传感器可以定量检测STX,具有良好的特异性和重现性.

目的 建立全血和尿液中 3 种麻痹性贝类毒素(石房蛤毒素、脱氨甲酰基石房蛤毒素和新石房蛤毒素)的超高效液相色谱—串联质谱检测方法 .方法 用乙腈-0.1%乙酸甲醇(1:3,v:v)提取血液样本,用甲醇(含0.5%乙酸)提取尿液样本后过PA固相萃取柱,选用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱.质谱仪采用电喷雾离子源,正离子扫描,多反应监测模式检测,外标法定量.结果 血添加样本中,石房蛤毒素、脱氨甲酰基石房蛤毒素和新石房蛤毒素分别在 0.5～100 ng/mL、1～100 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)≥0.996,毒素的检出限LOD分别为 0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、0.5 ng/mL,定量限LOQ分别为 0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、1.0 ng/mL.方法 的回收率为 63.23%～81.77%,日内精密度为 3.06%～9.58%,日间精密度为 3.87%～9.96%,准确度为 91.67%～102.42%.尿添加样本中,3 种毒素均在 1～100 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)≥0.996,毒素的检出限为 0.5 ng/mL,定量限为 1.0 ng/mL,回收率为 65.30%～74.34%,日内精密度为 3.18%～6.79%,日间精密度为 5.60%～7.81%,准确度为 96.25%～101.25%.结论 本实验建立了同时检测血液、尿液生物样本中石房蛤毒素、脱氨甲酰基石房蛤毒素和新石房蛤毒素的UPLC-MS/MS方法 ,可用于麻痹性贝类毒素实际中毒案件中毒素的鉴定.本方法 灵敏度高,重现性好,样本用量少,可以同时对 3 种麻痹性贝类毒素定性定量,适用于贝类毒素中毒案件中血液和尿液的检验.

目的 应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术筛选麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)中石房蛤毒素(saxitoxins,STX)的差异表达蛋白.方法 以小鼠神经母细胞瘤N2a为受试对象,使用浓度分别为10-8 mol/L和10-9 mol/L的STX标准品和阳性对照NSP(10-10 mol/L)进行染毒.提取细胞蛋白、定量和酶解.iTRAQ标记后(其中114标记空白组、115标记浓度组1 (STX10-8 mol/L)、116标记浓度组2(STX10-9 mol/L)、117标记阳性对照组(NSP10-10 mol/L)),进行LC-MS/MS分析.使用生物信息学方法对差异蛋白进行分析.结果 与空白组相比,共筛选出184个差异表达蛋白.与PSP相关的蛋白共有22个.筛选出的差异表达蛋白参与10种生物学过程、4种分子类型.结论 通过iTRAQ技术分析得到STX的差异表达蛋白,发现ABCB6、TLR8、TES、TIAM2可能是与STX毒素相关的蛋白分子.

目的:建立麻痹性贝类毒素体外生物毒性检测方法.方法:小鼠神经干细胞(NSC)培养于96孔培养板中,至对数生长期,每孔加入170μL培养液和10μL石房蛤毒素(STX)标准品(分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ng),再加入10 mmol/L的乌本苷10μL及1 mmol/L的藜芦碱10μL.同时设置乌本苷及藜芦碱对照孔,以及空白对照孔.CCK-8溶液孵育后用酶标仪测定各孔D(450)值,根据石房蛤毒素标准液含量与D(450)值之间的剂量反应关系,建立标准曲线.结果:培养的正常NSC第1天为单细胞悬液,第2～3天聚集成为小神经球,第4天为大神经球;加入乌本苷及藜芦碱后较多细胞出现肿胀破裂,加入STX后可见肿胀或破裂死亡的细胞,但细胞形态多为正常.并于0.2～1.0 ng范围内建立了麻痹性贝类毒素体外生物毒性检测方法并建立了标准曲线,其回归方程为y=1.252+0.495x(r=0.9980,P<0.01).结论:成功建立了麻痹性贝类毒素体外生物毒性检测方法,该研究为神经性贝类毒素的体外检测相关研究奠定了基础.

目的 通过Ames实验以及体外哺乳类细胞染色体畸变实验探索石房蛤毒素是否存在致突变性.方法 通过Ames实验,选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102菌株,经过菌株鉴定及菌株毒性实验,在有、无代谢活化系统存在的情况下分别对石房蛤毒素以每皿0.04、0.2、1.0 μg 3个剂量组进行实验,了解其是否具有致突变性.通过体外哺乳类细胞染色体畸变实验,采用MTT法检测石房蛤毒素对CHL细胞毒性,依据IC50确定实验剂量后染毒,制片、吉姆萨染色,镜下观察染色体畸变数量及类型,计算畸变率,评价其致突变性.结果 在有、无S9活化系统条件下,在每皿0.04、0.2、1.0 μg测试浓度范围内,石房蛤毒素对测试菌株诱发产生的回变菌落数未达到溶剂对照组回变菌落数的2倍,且无剂量反应关系.石房蛤毒素对CHL细胞毒性测定结果显示,有S9时,其IC50值为1.20 mg/mL;无S9时,其IG50值为1.34 mg/mL.石房蛤毒素对CHL细胞染色体畸变作用的研究结果显示,各剂量组分别在加入S9混合液和未加S9混合液条件下染色体畸变数及畸变率与阳性对照组比较,存在显著性差异(P＜0.05);与阴性对照组比较,均无显著性差异(P＞0.05).结论 在该实验条件下,石房蛤毒素未见致突变性.

目的 建立一种快速、高效、准确的同时测定贝类中石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、膝沟澡毒素(GTX1、GTX2、GTX 3与GTX4)、N-磺酰氨甲酰基类毒素(GTX5)、脱氨甲酰基类毒素(dcGTX2、dcGTX3与dcSTX)等10种麻痹性贝类毒素的基质分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱方法(MSPD-HPLC-MS/MS).方法 样品采用自制的纳米TiO2修饰磁性氧化石墨烯为MSPD吸附剂,一步实现样品的萃取与净化;目标分析物在ACQUITY UPLC BEH Amide柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱上以乙腈和含有2 mmol/L甲酸铵与0.25％甲酸的水溶液为流动相进行分离,在电喷雾离子源(ESI)正负离子多反应监测(MRM)模式下进行检测.结果 10种麻痹性贝类毒素在5.0 μg/kg～400 μg/kg具有良好的线性(r＞0.999 0),检出限为0.73 μg/kg～6.01 μg/kg,最低定量限为2.43 μg/kg～20.0 μg/kg,RSDs为2.2％～6.2％,加标回收率为80.6％～106％.结论 本法可用于贝类中STX、neoSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3与dcSTX等10种麻痹性贝类毒素的快速筛查与确证分析.

[目的]探究石房蛤毒素(STX)完全抗原制备方法和STX多克隆抗体免疫方案.[方法]通过碳二亚胺法(EDC)和高碘酸盐法(periodate reaction) 2种交联方法,将小分子石房蛤毒素与牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)和孔血蓝蛋白(KLH)分别进行交联,制备了6种形式STX完全抗原,并对交联物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和紫外吸收峰迁移变化鉴定.分别将EDC法和高碘酸盐法交联的STX-BSA、STX-KLH 4种完全抗原作为免疫原,对 Balb/c 小鼠进行免疫,获得 STX 多克隆抗体.通过间接ELISA法,对不同方法制备的多克隆抗体进行分析比较.[结果]在石房蛤毒素完全抗原的制备中,在交联方法的选择上,EDC法较高碘酸盐法更具优势;而在免疫原的选择上,STX-BSA完全抗原效果最好.[结论]本研究探究了2种制备STX完全抗原的方法,为今后多克隆抗体生产以及特异性单克隆抗体筛选提供数据支撑.

海洋生物毒素是海洋生物体内一类特殊的生物活性物质,其结构新颖、种类繁多、活性广泛,是神经科学研究的重要工具药物和海洋药物研发的宝贵资源.研究表明,河鲀毒素、石房蛤毒素以及芋螺毒素具有良好的镇痛活性,有望开发为新一代的镇痛药物;海葵毒素能有效调节T淋巴细胞增殖,有望开发成为治疗自身免疫性疾病的新型靶向药物;大田软海绵酸能够抑制丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,诱发类似阿尔茨海默病的病理生理变化,是研究阿尔茨海默病的一种重要工具药物.本文对几种代表性海洋生物毒素的生源分布、结构特点、毒理作用和应用前景等进行概述,并介绍其检测方法研究进展,为海洋生物毒素的开发利用提供参考.

为从分子水平解析热带特征性蓝藻-拉氏拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii,简称拟柱孢藻)环境适应机制,研究以广东省镇海水库中分离的拟柱孢藻藻株N8为材料,采用PacBio单分子实时测序技术(Single Molecule Real-Time,SMRT)进行测序,并初步进行全基因组特征的比较分析.结果显示拟柱孢藻N8全基因组大小为3.857 Mb,GC含量为40.13％,预测编码基因个数为3598个,在COG、KEGG和GO数据库中注释到的基因数分别为2429、1664和2244个.N8藻株与美国国立生物技术信息中心(NCBI)上公布的27株拟柱孢藻基因组大小和GC含量基本一致,但N8的编码基因数最多.基于拟柱孢藻全基因组单拷贝基因的系统进化树表明N8藻株与韩国藻株GIHE 2018的亲缘关系最近.N8藻株的基因组中未发现拟柱孢藻毒素(CYN)和石房蛤毒素(STX)合成酶基因簇,表明该藻株不产蓝藻毒素CYN和STX.对N8藻株和其他7藻株的磷吸收转运通路比较分析表明,这些藻株均拥有较为完整的磷吸收转运基因(双组分调节系统、低亲和力无机磷转运基因、高亲和力无机磷转运系统、有机磷酸盐转运复合体、C-P裂解酶和碱性磷酸酶),表明拟柱孢藻具有灵活利用环境中不同形态磷源的潜能;而不同藻株间的基因拷贝数和排列顺序存在差异,如拟柱孢藻N8基因组中有2个C-P裂解酶复合体蛋白phnF和phnM,其余7株拟柱孢藻则只有1个,表明拟柱孢藻存在株系特异性.N8藻株为中国首株公开完成全基因组测序数据的拟柱孢藻,对其基因组分析和磷吸收转运通路的解析将有助于阐明华南地区拟柱孢藻水华优势形成的分子机制.

目的 对海南省2018-2021年市售贝类进行麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)检测,以此了解海南省市售贝类中麻痹性贝类毒素污染状况.方法 对2018-2021年海南省13个市(县)常售7种贝类中10种PSP:石房蛤毒素(saxitoxin,STX)、新石房蛤毒素(neosaxitoxin,neoSTX)、漆沟藻毒素 1(gonyautoxins 1,GTX1)、漆沟藻毒素 2(gonyautoxins 2,GTX2)、漆沟藻毒素 3(gonyautoxins 3,GTX3)、漆沟藻毒素 4(gonyautoxins 4,GTX4)、漆沟藻毒素 5(gonyautoxins 5,GTX5)、脱氧甲酰基类石房蛤毒素(decarbamoylsaxitoxin,dcSTX)、脱氧藤沟藻毒素2(decarbamoylgony-au toxins 2,dcGTX2)、脱氧藤沟藻毒素3(decarbamoylgonyau toxins 3,dcGTX3)的含量进行分析.结果 360份贝类中PSP检出率为10.3％.其中STX检出率最高为5.83％;其次为GTX2检出率为4.17％;neoSTX和GTX3检出率均为1.67％;GTX1检出率为1.39％;GTX4、GTX5、dcSTX、dcGTX2和dcGTX3这5种PSP均未检出.扇贝检出PSP种类有4种,牡蛎、贻贝和蚶均检出2种,带子仅检出1种,蛤和蛏未检出PSP.扇贝单份样本最多检出PSP为4种,牡蛎、带子、贻贝和蚶单份样本最多检出PSP均为1种.所有样本测定PSP的当量为未检出～155.6μg/kg,此次检测样本均未超标.PSP年检出率由高到低为:2020年20.0％,2019年15.6％,2018年5.3％,2021年2.0％.2018-2020年可连续检测到STX,2018年全部为STX,2019年除了在扇贝和蚶中检测到STX外,还分别从牡蛎、贻贝和蚶中检测到neoSTX.2020年,仅从扇贝中检出PSP,阳性标本中均可检出GTX2,同时混检出5份STX、5份GTX1、6份GTX3.2021年仅从扇贝中检测到GTX2.12个市(县)市售贝类检出STX,10个市(县)检出GTX2,5个市(县)检出neoSTX,GTX1和GTX2分别在4个市(县)有检出.文昌和陵水市售贝类检出5种类型PSP.结论 海南省市售部分贝类存在某种PSP污染风险,应加强市售贝类PSP的监管.