[目的]禽痘病毒(FPV)是痘病毒科禽痘病毒属的成员.FPV因其基因组庞大,含有大量复制非必需区,目前作为活病毒载体在禽类和哺乳动物中广泛使用.重组位点的选择是禽痘病毒载体构建的先决条件,外源基因的插入不影响病毒复制是筛选插入位点的前提.因此,鉴定可供外源基因插入的复制非必需位点将为重组病毒的构建提供更多选择.本研究拟鉴定FPVNX10株胸苷激酶(TK)基因在病毒复制中的必要性.[方法]以TK基因作为靶基因,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记构建转移载体,FPV NX10株为亲本病毒,通过同源重组筛选重组病毒rFPV-△TK-EGFP.通过在CEF细胞培养物中添加5-溴脱氧尿苷(BUdR)验证TK基因在FPV复制中的作用.[结果]构建了转移栽体pUC 19-TK AB-EGFP.在转染后重组病毒克隆纯化过程中,蚀斑克隆中绿色荧光病变所占的比例逐渐增加,但在荧光蚀斑的边缘能观察到不带荧光病变的存在.对第9-15轮随机选取的蚀斑克隆的Western blot分析表明,重组病毒中插入的EGFP基因均能够正确表达,但PCR结果显示在重组病毒中始终存在野生型病毒.在细胞培养液中添加BUdR后,重组病毒不能继续生长.[结论]FPV NX10毒株TK基因在该病毒的复制中不是完全非必需的.

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒.HBV的致病机制尚不完全清楚,临床上常用的抗病毒药物干扰素、核苷类似物等能抑制病毒复制,但不能治愈绝大多数HBV感染者[1].据估计,全球大约有3.5亿至4亿HBV慢性感染者,每年有50万至120万人死于HBV相关肝硬化、原发性肝癌等疾病[2-3].HBV基因组含4个开放阅读框(open reading frames,ORFs),即pre-S/S、pre-C/C、X、P,其中X基因是其中最小的基因[4-5],该基因编码HBV X蛋白(HBV X protein,HBx),HBx是多种病毒、细胞启动子和增强子的反式激活因子,其转录活性是HBV复制所必需的[6].了解病毒与宿主之间的相互作用,有助于揭示HBV感染的致病机制以及发现新型抗病毒治疗方法.

兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)及兔粘液瘤病毒(Myxoma virus,MYXV)分别引起兔出血症(兔瘟)和兔粘液瘤病,是两种严重危害家兔养殖业以及导致原产地欧洲野兔-穴兔(Oryctolagus cuniculus)种群近濒危的重要病原.VP60为构成RHDV衣壳的主要抗原蛋白.为研制能同时免疫预防该两种疫病的重组二联疫苗,本研究分别以MYXV和其复制非必需基因——胸腺激酶(Thymidine kinase,TK)基因为重组载体和同源重组靶基因,构建穿梭载体p7.5-VP60-GFP.将p7.5-VP60-GFP载体转染被MYXV感染的兔肾细胞株RK13,经同源重组后,在荧光显微镜下筛选出表达GFP的重组病毒,并将其命名为rMV-VP60-GFP.通过PCR和Western blotting进行重组病毒vp60基因特异性插入和表达验证结果显示,vp60和gfp基因成功插入MYXV基因组中并且可成功表达,表明成功构建了表达RHDV衣壳蛋白基因vp60的重组MYXV.动物攻毒保护试验表明,制备的重组病毒能保护家兔抵抗MYXV的致死性攻击,这为后续疫苗的研发奠定了基础.

黄病毒科黄病毒属是由一组含单股正链RNA基因组的囊膜病毒组成,包括登革病毒、流行性乙型脑炎病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒等,经由虫媒传播,可引起人类和动物的严重虫媒病毒病.黄病毒基因组由1个开放阅读框、5'非编码区和3'非编码区三部分组成.5'和3'非编码区含有病毒基因组复制所必需的启动元件;高度结构化的3'非编码区负责黄病毒亚基因组RNA的产生,从而有助于病毒逃避宿主免疫反应;此外3'非编码区还可作为疫苗研究的靶标.鉴于非编码区在黄病毒的蛋白翻译、基因组复制和免疫调节中发挥的重要作用,本文就黄病毒基因组非编码区的结构与功能最新研究进展作一简要综述.

真核生物中染色体 DNA 复制的起始是一个被高度调控的过程,所有细胞的染色体 DNA 复制都需要大量必需和非必需的蛋白质在空间和时间上协调的复杂相互作用[1].GINS(go,ichi,ni,san)作为CMG(CDC45,MCM2-7,GINS)复合物的一部分,是真核生物 DNA 复制机制中的重要环节,参与了真核生物 DNA 复制的过程,并通过不同途径在其中发挥作用,对于染色体复制的起始和 DNA 复制的正常进行都是必需的[2].而 GINS 基因家族也在众多肿瘤中被发现高表达,并且促进肿瘤的发生及发展,且被发现为很多肿瘤的独立预后因素,并为一些肿瘤的治疗提供了新的靶点.现就 GINS 的作用及其在肿瘤中的表达和预后意义综述如下.

冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是基因组最大的一类单股正链RNA病毒,多数可以跨物种传播并感染人类,是当前引起重大公共卫生事件、严重威胁人类健康的病原之一.病毒基因组全长约25-31 kb,编码多个非结构蛋白、结构蛋白(S、E、M、N)及附属蛋白.对于大多数冠状病毒来说,附属蛋白虽然是病毒复制的非必需蛋白,但往往在病毒的致病过程中发挥重要作用,是冠状病毒重要的功能蛋白.该类蛋白位于病毒基因组的3'端,由位于基因起始位置的转录调控序列(Transcription Regulating Sequence,TRS)调控其mRNA的转录,而且蛋白编码序列的密码子使用偏爱性对蛋白翻译也产生重要影响.附属蛋白具有跨膜蛋白的属性和独特的蛋白转运基序,后者对该类蛋白跨膜区的形成、拓扑学结构及蛋白的细胞内运输过程起决定性的作用,从而直接影响附属蛋白的功能.本文首先总结了冠状病毒最新的分类及基因组结构;然后从附属蛋白的种类、功能、蛋白转运基序、拓扑学结构及密码子使用偏爱性等方面系统概述了相关研究进展,并对下一步的研究方向进行了展望,为更加全面地认识冠状病毒附属蛋白的生物学特性提供重要参考.

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种出血性、致死性的猪烈性传染病.ASF在全球广泛传播,给养猪业造成重大的经济损失.ASFV基因组庞大,可编码150多种蛋白,一些非必需基因编码的蛋白与调控病毒毒力、复制和免疫逃逸等相关.通过删除ASFV毒力相关的非必需基因所构建的减毒株是当前比较有前景的疫苗,然而其安全性有待提高.系统地鉴定ASFV非必需基因及其功能,不仅有助于ASF基因缺失疫苗的研发,也有益于ASFV致病机制研究.本文对目前已鉴定的ASFV非必需基因及其功能研究进行了总结分析,着重讨论了影响ASFV毒力、调控病毒复制、参与免疫逃逸的非必需基因及其编码蛋白的功能,旨在加深对ASFV病原学的认识,为新的ASFV非必需基因的鉴定和功能研究提供参考.

在蓝藻合成生物学中,对大片段进行无标记删除可以加快基因组简化的进程.研究以聚球藻PCC 7942为材料,基于同源重组技术对基因组中大于10 kb的3个非必需区域进行无标记删除.构建带有两侧同源片段的不可在聚球藻复制的质粒,利用接合转移将其导入藻细胞获得同源单交换株,再借助于条件致死基因sacB筛选第二步交换的克隆,获得无标记删除突变株.研究证明了传统的同源重组和筛选技术可用于蓝藻基因组的大片段无标记删除.

乳酸是细胞呼吸的产物.葡萄糖进入细胞后,在己糖激酶等的催化作用下通过糖酵解代谢成丙酮酸.当细胞氧供充足时,丙酮酸通过线粒体基质中的丙酮酸脱氢酶转化为乙酰辅酶A参与三羧酸循环,为细胞提供必需的能量.当细胞缺氧时,丙酮酸由胞质中的乳酸脱氢酶催化生成乳酸.乳酸不仅为线粒体呼吸提供能量源,还通过自分泌、旁分泌和内分泌等形式在炎症反应、创伤修复、记忆形成和神经保护以及肿瘤生长和转移等病理生理过程中发挥重要作用,影响疾病发展和预后.表观遗传修饰是通过修饰酶共价添加或水解组蛋白和DNA结构中的功能基团以调节基因复制、转录和翻译等过程,影响细胞生物学效应.组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白,其翻译后修饰诸如甲基化、乙酰化等影响其与DNA双链的亲和性,改变染色质结构,广泛参与基因的表达调控.最新研究发现组蛋白上可以发生乳酰化修饰,即通过对组蛋白上的赖氨酸残基添加乳酸基团,使其作为一种全新的表观遗传修饰发挥作用.随着研究的深入,乳酰化修饰也被证明广泛发生在非组蛋白上.乳酰化修饰的发现扩大了对乳酸参与疾病病理机制的认识.该文主要综述了乳酰化修饰在肿瘤、炎性疾病和神经系统疾病中的作用和机制,以期为相关疾病的研究与诊疗提供新思路.