目的:回顾性总结和分析进行性肌阵挛癫痫(PME)患者的临床表型和基因型。方法:收集2017年6月至2022年12月浙江大学医学院附属第一医院神经内科确诊的11例PME患者的临床资料，包括基本信息、脑电图、体感诱发电位、头颅MRI以及基因检测的结果，进行分析和总结。结果:在纳入研究的11例PME患者中，男性4例，女性7例，就诊时均超过14岁。首发症状为肌阵挛者3例。通过基因检测明确诊断者8例，包括 NEU1基因变异3例、 EPM2A基因变异2例、 MT- TK基因变异1例、 ATN1基因变异1例、 CSTB基因变异1例。有3例未发现明确的致病性变异。在8例确诊的患者中，符合唾液酸沉积症1型者有3例，拉福拉病(LBD)2例，齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)1例，波罗的海肌阵挛(EPM1)1例，肌阵挛癫痫伴破碎样红纤维(MERRF)1例。 结论:成人神经科确诊的PME亚型多在青少年和成年早期发病，病情进展相对缓慢，大多数患者的认知功能损害相对较轻。

目的:观察微小RNA(miRNA，miR)-29a-5p在心肌梗死后心室重塑心肌纤维化中的作用，探讨miR-29a-5p通过靶基因Endoglin调控心肌梗死后心肌纤维化的作用机制。方法:选取2019年1月至2019年10月在郑州大学第二附属医院收治的30例心肌梗死患者和20例非急性冠脉综合征的患者，取血液标本，分别进行血清miR-29a-5p和NTPRO-脑钠肽(BNP)的检测。体内实验，建立小鼠心肌梗死模型，尾静脉分别注射miR-29a-5p mimics和阴性对照试剂。4周后处死小鼠，取部分心肌组织用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分别对miR-29a-5p、Endoglin、BNP进行检测。体外实验，处死1日龄小鼠，分离获得心肌成纤维细胞并进行培养。将培养的细胞用脂质体2000对细胞进行转染miR-29a-5p mimics和阴性对照试剂，转染后加入50 μmol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)或等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)持续48 h。用图像J软件检测各组成纤维细胞的表面积。另取细胞用miR-29a-5p mimics或antagomir，pRL-TK-endoglin-3’端非编码区(3’UTR)载体，pGL3-basic质粒进行共转染。转染48 h，获得细胞，用双荧光素酶报告试验系统检测细胞相对荧光素酶活性，并用Real-time PCR和Western blot分别检测Endoglin在各组的表达。采用单因素方差分析和LSD检验。结果:急性心肌梗死(AMI)患者血清中miR-29a-5p含量[(3.57±0.53) ng/ml]明显降低( F＝935.899， P<0.01)，NTPRO-BNP含量明显升高[(9.47±5.06) ng/ml， F＝65.440， P<0.01]。小鼠MI组miR-29a-5p表达水平明显降低(0.51±0.12， t＝4.315， P<0.01)，在AngⅡ诱导的心肌纤维化模型中同样发现miR-29a-5p的表达水平明显降低(0.65±0.26， t＝4.511， P<0.01)。miR-29a-5p mimics处理心肌成纤维细胞中Endoglin蛋白含量和mRNA表达水平降低(0.49±0.09， t＝352.312， P<0.01)，在miR-29a-5p antagomir处理心肌成纤维细胞中Endoglin蛋白含量和mRNA表达水平升高(2.15±0.14， t＝7.814， P<0.05)。 结论:miR-29a-5p是心肌纤维化的重要调节因子。

目的:以痘苗病毒中和抗体表位D8L区为重组位点进行外源基因替换，从而降低载体自身免疫原性。方法:通过同源重组技术，插入表达流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)序列，对D8L区进行替换，构建重组痘苗病毒流感疫苗，同时以表达相同HA的TK区重组痘苗病毒疫苗为对照。Western blot对HA的表达进行验证；小鼠实验、ELISA、血凝抑制试验检测每次免疫后2周的血清抗体效价，攻毒保护试验评价重组痘苗病毒的保护效力。结果:Western blot表明构建的重组疫苗均能正确表达HA D8L蛋白。ELISA、血凝抑制试验显示，初次免疫后，D8L区突变的重组痘苗病毒疫苗HA抗体效价略高于TK区突变的重组疫苗，并随着免疫次数的增多差异有统计学意义( P<0.05)；其免疫原性显著低于TK区突变的重组疫苗( P<0.05)，随着免疫次数增加，二者差异无统计学意义( P>0.05)。H1N1pdm攻毒后保护效力评价结果显示，D8L区突变组可完全清除病毒，且小鼠肺部炎症水平更低、组织损伤更少。 结论:通过将外源基因插入到痘苗病毒载体中和抗体表位D8L区，有助于降低载体自身的免疫原性，并提高外源基因的免疫原性，为痘苗病毒载体在疫苗或基因治疗领域作为递送工具提供了参考。

目的:利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸腺激酶(thymidine kinase，TK)区进行定向重组，建立高效的痘苗病毒靶基因插入重组技术。方法:设计合成靶向TK区的引导RNA(guide RNA, gRNA)对应的2条互补寡核苷酸，磷酸化修饰后变性退火，克隆到去除核定位信号的PX458载体上，同时改造原有TK区重组质粒。将gRNA及Cas9共表达质粒转染293T细胞，介导VACV与TK区重组质粒进行同源重组，然后通过蓝白斑的出现率评估病毒重组率。结果:本研究中设计并合成的gRNA序列介导的重组效率大于1%，高于经典的同源重组方法10倍以上。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了高效痘苗病毒TK区重组体系，为新发突发传染病的疫苗或多价研究以及肿瘤治疗等提供临床前研究技术支持。

目的:探究血清垂体瘤转化基因1（pituitary tumor tansforming gene1，PTTG1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）水平与喉癌、下咽癌短期预后的相关性及预后不良影响因素。方法:选取2017年1月至2021年12月青岛大学附属青岛市中心医院就诊的117例喉癌及下咽癌患者作为观察组，另选取同期就诊的142例喉良性病变患者作为对照组。酶联免疫吸附法检测两组患者的血清PTTG1、VEGF、TK1水平。对观察组患者进行为期1年的术后短期预后随访，根据随访结果将其分为预后良好组和预后不良组。比较两组患者的临床资料及术前血清PTTG1、VEGF、TK1水平， Spearman相关性分析血清PTTG1、VEGF、TK1水平与患者短期预后不良的相关性，单因素和多因素Logistic回归分析患者预后不良的影响因素。 结果:观察组血清PTTG1（139.18±25.13）pg/ml、VEGF（466.19±27.14）pg/ml、TK1（4.09±0.59）pmol/L均显著高于对照组，差异有统计学意义（ P<0.001）。观察组117例患者中，96例预后良好，21例预后不良。预后良好组与预后不良组患者的性别、年龄、肿瘤直径、组织学分化程度、临床分期、淋巴结转移、血清PTTG1、VEGF、TK1比较，差异有统计学意义（ P<0.05）。 Spearman相关性分析显示，血清PTTG1、VEGF、TK1水平与短期预后不良呈正相关（ r=0.593、0.544、0.698， P<0.01）。Logistic分析显示，年龄、肿瘤直径、组织学分化程度、临床分期、淋巴结转移、血清PTTG1、血清VEGF、血清TK1均为预后不良的独立影响因素（ P<0.05）。 结论:血清PTTG1、VEGF、TK1水平与喉癌、下咽癌短期预后存在相关性，患者短期预后不良影响因素较多，可综合应用于疾病的预后评估中。

目的:通过生物信息学方法筛选出肝癌中的关键基因，并预测其在肝癌发生中的潜在分子机制及其对肝癌预后的影响。方法:通过基因表达综合数据库(GEO)下载3个肝癌微阵列数据集，进行差异分析并取其交集。利用DAVID数据库对187个差异表达基因(DEGs)进行功能富集分析。通过STRING数据库及Cytoscape软件构建DEGs的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络及筛选关键基因。利用GEPIA、GSCALite数据库进行关键基因通路、表达验证及预后分析。结果:获得185个3个数据集交集的DEGs，包括54个上调基因和131个下调基因，这些基因生物功能主要富集在细胞分裂和细胞凋亡，主要参与细胞周期、DNA复制、Rap1信号通路的调节。在PPI网络中筛选出10个关键基因，分别为胸苷激酶1(TK1)、细胞分裂周期相关5(CDCA5)、甲状腺激素受体相互作用体13(TRIP13)、着丝粒蛋白M(CENPM)、异常纺锤形微管组件(ASPM)、着丝粒蛋白F(CENPF)、微型染色体维护复合体组件49(MCM4)、霍利迪连接体识别蛋白(HJURP)、母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)、非染色体结构维护凝缩蛋白Ⅰ复合体G亚基(NCAPG)。关键基因在肝癌中高表达，除UBE2C外，关键基因高表达与肝癌患者总生存率低相关。结论:关键基因与肝癌的发生和预后不良有关。

目的:分析经肝动脉灌注介入治疗对行肝癌微波消融术患者血清胸苷激酶1(TK1)及趋化因子CXC配体13(CXCL13)水平的影响。方法:以本院2014年12月至2019年1月期间诊治的行肝癌微波消融术患者为研究对象进行前瞻性研究。140例患者采用随机数字表法分为两组：对照组( n＝70)患者行肝癌微波消融术治疗，观察组( n＝70)患者行肝癌微波消融术前行经肝动脉灌注化疗，分析两组患者的临床效果及治疗前后血清TK1及CXCL13水平的变化情况。 结果:观察组患者的总有效率明显高于对照组患者(92.9% vs 81.4%， P<0.05)，两组患者经治疗后谷草转氨酶[观察组(40.4±6.69)U/L，对照组(52.3±8.33)U/L]、谷丙转氨酶[观察组(40.1±6.96)U/L，对照组(49.9±6.97)U/L]及总胆红素[观察组(24.5±3.96)mmol/L，对照组(35.2±6.31)mmol/L]水平均明显降低( P<0.05)；治疗后患者血清中TK1[观察组(10.5±3.69)μg/L，对照组(15.4±4.28)μg/L]及存活素[Survivin，观察组(12.6±2.54)μg/L，对照组(19.2±4.15)μg/L]水平明显降低( P<0.05)；而染色体10上磷酸同源性张力缺失基因[PTEN，观察组(46.9±5.33)μg/L，对照组(30.2±4.77)μg/L]水平明显升高( P<0.05)，CXCL13[观察组(20.3±4.58)μg/L，对照组(32.5±5.11)μg/L]、CXCL16[观察组(23.3±4.77)μg/L，对照组(31.2±5.24)μg/L]及CXC趋化因子受体5(CXCR5)[观察组(10.1±2.77)μg/L，对照组(14.6±2.96)μg/L]水平明显降低( P<0.05)，且观察组患者经治疗后上述指标的变化程度较对照组患者的变化更明显( P<0.05)。 结论:经肝动脉灌注介入治疗对行肝癌微波消融术有效率更高，且能有效降低患者血清TK1及CXCL13水平。

目的:分析Peutz-Jeghers综合征(PJS)患者 STK11突变及其与肠套叠累积危险度的关系。 方法:收集2017年12月至2019年6月于空军特色医学中心就诊的167例PJS患者的临床资料，包括患者的性别、年龄、家族史、首次发生肠套叠的年龄和基因检测结果。采用Kaplan-Meier法分析不同突变类型患者肠套叠的累积危险度。统计学方法采用Wilcoxon秩和检验和log-rank检验。结果:在167例患者中，89.8%(150/167)的患者发生 STK11突变，其中50.7%的突变位点在1、4、5号外显子；70.6%(118/167)的患者发生肠套叠；患者首次发生肠套叠的中位年龄(范围)为15岁(2～52岁)。118例发生肠套叠的PJS患者中，有家族史53例，无家族史65例；男70例，女48例，有无家族史、不同性别PJS患者肠套叠累积危险度的差异均无统计学意义( P均>0.05)； STK11突变107例(90.7%)为 STK11突变组， STK11未突变11例(9.3%)为 STK11未突变组， STK11突变组首次发生肠套叠中位年龄低于 STK11未突变组(15岁比31岁)，差异有统计学意义( Z＝-2.108， P＝0.035)。 STK11突变组中，无义突变29例(27.1%，无义突变组)，框移突变23例(21.5%，框移突变组)，错义突变21例(19.6%，错义突变组)，剪切突变26例(24.3%，剪切突变组)，其他突变类型8例(7.5%)。 STK11突变组与 STK11未突变组、剪切突变组与 STK11未突变组、错义突变组与 STK11未突变组间肠套叠的累积危险度的差异均有统计学意义( χ2＝5.570、10.167、6.653， P均<0.05)；无义突变组与 STK11未突变组、框移突变组与 STK11未突变组，以及剪切突变、无义突变、错义突变、框移突变组间肠套叠的累积危险度的差异均无统计学意义( P均>0.05)。 结论:STK11突变的PJS患者首次发生肠套叠的年龄较小，累积危险度高。 STK11突变类型对PJS患者肠套叠的风险评估具有潜在价值。

目的 探讨在牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,P.g-LPS)诱导的牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)炎症环境下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)响应型纳米颗粒PssL-NAC对HGFs内ROS、炎症因子、胶原蛋白生成、细胞迁移功能以及Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)-核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路蛋白表达的影响.方法 本研究已通过单位伦理委员会审查批准.通过响应ROS的硫缩酮键(thioketal,TK)连接聚己内酯(polycaprolactone,PCL)的疏水端和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)的亲水端,水相油相自主装的方式得到内部包裹油溶性的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine-NAC)的PssL-NAC微球,制备NAC水溶液,并使用透射电镜观察验证纳米粒子合成成功.在提取的HGFs中分别加入P.g-LPS(0、5、10μg/mL),P.g-LPS(0、5、10μg/mL)+NAC,P.g-LPS(0、5、10μg/mL)+PssL-NAC,共聚焦显微镜观察不同组别细胞内ROS水平,确定后续实验使用的P.g-LPS浓度.将HGFs随机分为空白对照组(对照组,不做处理),P.g-LPS组(P.g-LPS处理细胞),NAC组(P.g-LPS+NAC处理细胞),PssL-NAC组(P.g-LPS+PssL-NAC处理细胞).通过细胞增殖与毒性实验验证PssL-NAC的生物安全性.使用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐探针与细胞共孵育通过荧光实时定量检测细胞内炎症因子白细胞介素6(inter-leukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen 1,COL1)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen 3,COL3)的基因水平;通过划痕实验观察PssL-NAC对牙龈成纤维细胞的迁移功能的影响;通过免疫印迹法检测TLR4-NFκB信号通路相关蛋白的表达.结果 PssL-NAC具有良好生物相容性,对HGFs的细胞增殖能力无显著影响(P>0.05);在P.g-LPS浓度升高的条件下,PssL-NAC能维持细胞内大约两倍对照组的ROS水平(P<0.001);PssL-NAC能显著降低P.g-LPS诱导升高的IL-6(P<0.001)、TNF-α基因水平(P<0.001),上调COL1基因水平(P<0.001);P.g-LPS刺激后,PssL-NAC能将细胞迁移能力恢复至对照组水平(P>0.05),并降低TLR4-NF-κB通路中TLR4(P<0.001)、p65(P=0.006)、p-p65(P=0.017)蛋白的表达.结论 PssL-NAC维持细胞内适宜浓度ROS,通过TLR4-NF-κB通路减轻P.g-LPS诱导的细胞炎症,并恢复炎症条件下的细胞胶原生成和细胞迁移功能.

目的 建立以成纤维细胞激活蛋白(FAP)基因启动子为响应元件的新双荧光素酶报告基因系统建的心肌纤维化防治药物筛选方法.方法 体外扩增小鼠FAP基因启动子片段,克隆至psiCHECK2质粒替换HSV-TK启动子,获得新的重组质粒psiCHECK2-FAP.重组质粒经限制性内切核酸酶HindⅢ消化后,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并纯化片段测序验证;将psiCHECK2-FAP瞬时转染至小鼠心肌成纤维细胞(MCF)培养24h后,分别给予转化生长因子β1(TGF-β1)5 μg·L-1,血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)1 μmol·L-1或棕榈酸(PA)100 μmol·L-1 处理 0,12,24 和 48 h,双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性.将psiCHECK2-FAP瞬时转染至MCF细胞培养24h后,达格列净(Dapa)1 μmol·L-1预处理1h,再分别添加TGF-β1(5 μg·L-1),Ang Ⅱ(1 μmol·L-1)或PA(100 μmol·L-1)处理24 h,双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性,Western印迹法检测MCF细胞中Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和ColⅢ的蛋白表达.结果 HindⅢ将psiCHECK2-FAP切成2个片段且条带大小符合预期,测序结果与理论序列完全一致.与空白对照组相比,TGF-β1,AngⅡ和PA组均可显著增加MCF细胞中ColⅠ和ColⅢ表达(P<0.05,P<0.01);分别与TGF-β1,AngⅡ或PA组相比,Dapa干预后则显著降低ColⅠ和ColⅢ表达(P<0.05,P<0.01);与空白对照组相比,TGF-β1,AngⅡ或PA均可显著增加荧光素酶活性(P<0.05,P<0.01),24 h达最大值;分别与TGF-β1,AngⅡ或PA相比,Dapa干预后则显著降低荧光素酶活性(P<0.05,P<0.01).结论 以FAP基因启动子为响应元件的新双荧光素酶报告基因系统在MCF细胞中对促心肌纤维化因子表现出较好的敏感性,为心肌纤维化防治药物的研发提供策略.