目的:分析构建的负载局部缓释给药的唑来膦酸(ZOL)-明胶纳米微球(GNPs)聚多巴胺(PDA)涂层多孔钛合金支架对破骨细胞的生物学影响。方法:基于电子束熔融技术构建多孔钛合金支架，利用去溶剂化法制备不同ZOL浓度（0、1、10、50、100、500 μmol/L）的ZOL-GNPs，两者复合构建负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架并进行表征分析，并对3种不同状况支架（裸多孔钛合金支架、PDA涂层多孔钛合金支架、负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架）进行生物力学检测，分别在第1、4、7、14、21、28天利用高效液相色谱仪进行药物释放检测。将破骨细胞与上述不同ZOL浓度的新型支架相复合，利用实时定量（RT）-聚合酶链式反应（PCR）检测破骨细胞相关基因表达；利用Western-blot技术检测破骨细胞相关蛋白表达。结果:成功构建了负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架，电镜扫描显示GNPs成球性好，表面光滑，分散均一，粒径为（243.6±63.4）nm，ZOL-GNPs均匀复合于支架的表面及孔隙内，球形规整无粘连。生物力学实验结果显示3种不同状况下多孔钛合金支架的弹性模量分别为（1.81±0.12）、（1.80±0.23）、（1.81±0.15）GPa，差异无统计学意义( P> 0.05)；多孔钛合金支架在第1天的释药百分比明显较高，在随后的27 d中，药物释放逐渐缓慢增加。低浓度ZOL支架组中，细胞黏附增殖较多；50 μmol/L组中则出现球状细胞；随后随着浓度的升高，球状细胞增多，甚至发生凋亡。RT-PCR结果显示Ctsk基因和TRAP基因在随着ZOL浓度升高而升高，其中在50 μmol/L时表达最高，然后随浓度升高而降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。Western-blot结果显示Ctsk与TRAP的表达水平与其相关基因表达水平趋势相似。 结论:构建的一种负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架不但具有良好的机械性能，还具有局部药物缓释抗OP作用；当ZOL浓度为50 μmol/L时，更有利于抑制破骨细胞生成。

目的 研究负载槲皮素的明胶三维多孔(G-quercetin)微球作为骨组织材料的可行性.方法 利用乳化法制备负载槲皮素的多孔明胶微球,扫描电镜观察微球形态,通过免疫荧光染色、活死细胞染色和CCK-8、碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红染色检测微球的细胞毒性及其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)黏附、增殖及分化的影响,RT-PCR检测成骨相关基因Runx-2、ALP、OPN、OCN表达.结果 扫描电镜结果显示制备的载槲皮素明胶三维微孔材料具有多孔结构.细胞黏附检测显示细胞能够在微球表面铺展良好.与对照组相比,活死细胞染色、CCK-8 结果显示该微球无明显细胞毒性(P＞0.05);与G-quercetin微球共培养的MC3T3-E1 ALP表达和体外矿化增加;PCR结果显示 Runx-2、ALP、OCN、OPN表达明显增高(P＜0.05).结论 载槲皮素明胶微球具有良好的生物相容性,能够促进MC3T3-E1 体外成骨分化,有望作为新型骨组织工程生物材料应用于临床.

目的 探讨载成纤维生长因子10(FGF10)的多孔明胶微球(GMSs)对脊髓损伤大鼠神经保护作用的机制.方法 20只健康雄性SD大鼠(220～250 g)随机分为假手术组、脊髓损伤组、FGF10组、FGF10-GMSs组,每组各5只.假手术组只咬除T9～T10棘突及椎板等骨性组织,不造成脊髓损伤.其余3组造成脊髓损伤后,用Hamilton微量注射器向FGF10组大鼠的损伤注入20μL FGF10,向FGF10-GMSs组大鼠的损伤处注射20μL FGF10负载的多孔明胶微球,脊髓损伤组和假手术组的大鼠注射等量的生理盐水.收集大鼠胸椎(T9～T10)脊髓组织,分别采用离体释放试验评估FGF10-GMSs的持续释放.使用大鼠脊髓损伤评分(BBB评分)和斜坡测试评估FGF10-GMSs对SCI大鼠的运动功能改善效果.使用HE、Nissl染色、TUNEL试验及Western blot评估FGF10-GMSs的治疗效果.结果 离体释放实验结果显示,普通明胶微球会在短时间内迅速释放FGF10,多孔明胶微球持续而缓慢地释放FGF10,未在初始48 h内观察到显著的爆发释放模式.BBB评分结果显示,与脊髓损伤组(5分)相比,第21天FGF10-GMSs组(12分)和FGF10组(9分)的大鼠均表现出良好的运动功能恢复(P<0.05),斜坡测试结果与BBB评分结果一致,FGF10组和FGF10-GMSs组均获得了明显的行为改变.HE、Nissl染色结果显示FGF10-GMSs组内的坏死、核崩解和浸润性多核白细胞数量较少,在脊髓腔内坏死组织的比例显著降低.Western blot测定结果显示FGF10-GMSs组中的细胞凋亡抑制程度比FGF10组中更加明显.TUNEL试验也产生类似的结果,相比FGF10组和脊髓损伤组,FGF10-GMSs组具有更加明显的抑制细胞凋亡的作用.结论 FGF10-GMSs通过抑制神经细胞的凋亡,从而达到保护脊髓损伤大鼠神经细胞的作用,为脊髓损伤的治疗提供新的思路,对提高脊髓损伤的预后具有十分重要的意义.

骨组织工程通过联合利用种子细胞、生物活性因子和支架材料等要素来构建骨组织再生微环境,从而促进骨缺损的修复重建来诱导骨再生.明胶微球具有多孔性、生物降解性、生物相容性及生物安全性等优势,是一种极具应用潜能的骨修复材料.明胶微球用于体外培养种子细胞时可实现高效扩增.多官能团结构使其可作为促血管再生因子、促骨再生因子及抗感染因子等多种药物的递送载体,缓释药物的同时也可实现微球的多功能化.在构建明胶微球支架时与其他生物材料复合及血管化性能的赋予可提高支架材料的综合性能,但目前支架的设计还存在如何兼顾材料多孔结构和力学性能的问题.本文主要综述了明胶微球的常见制备技术及其近年来在骨组织工程中的应用,并对未来的发展前景进行展望.

目的 探讨多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥(以下简称多孔复合骨水泥)修复兔腰椎骨缺损的效果.方法 采用Urist等的方法制备成年新西兰兔骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG),参考W/O/W复乳法制作聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic) acid,PLGA]空白微球,将PLGA空白微球和BMG与磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)复合,构建多孔复合骨水泥.通过体外抗溃散观察、孔隙率测定及生物力学试验,观察其理化特性;并以CPC作对照.取30只2月龄新西兰兔,制备L3椎体大小为4 mm×3 mm×3 mm的骨缺损后,分别填入多孔复合骨水泥(实验组,n=15)和CPC(对照组,n=15).术后第4、8、12周,X线片观察骨融合情况,micro-CT分析骨密度(bone mineral density,BMD)、骨体积分数(bone volume fraction,BVF)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th.)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N.)和骨小梁分离度(trabecular spacing,Tb.Sp.),组织学观察新生骨形成情况.结果 两种骨水泥均有较好抗溃散性,多孔复合骨水泥孔隙率为55.06％±1.18％,抗压强度为(51.63±6.73) MPa,与CPC的孔隙率(49.38％±1.75％)以及抗压强度(63.34±3.27) MPa相比,差异有统计学意义(t=4.254,P=0.006;t=2.476,P=0.034).X线片观察示,随时间延长,两组材料与宿主之间的边界逐步模糊,且实验组第12周时边界已消失、对照组仍可见.micro-CT检测各时间点实验组BMD、BVF、Tb.Th.、Tb.N.以及Tb.Sp.与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).组织学观察示,随时间延长,两组植入材料中均见新骨生长,其中实验组新生骨与宿主骨形成骨性连接,优于对照组.结论 多孔复合骨水泥具有骨诱导活性和骨传导双重作用,可以有效促进兔腰椎骨缺损修复重建.

目的 探讨明胶来源多孔微球的生物相容性,为进一步体内实验提供科学依据.方法 分离培养大鼠乳鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)并进行三系分化诱导和鉴定.P2代ADSCs体外种植于多孔明胶微球1d、3d和5d后,MTT法检测微球毒性和微球复合细胞后的增殖活性,激光共聚焦显微镜观察微球复合细胞后细胞形态、增殖活性.结果 分离培养的大鼠脂肪间充质干细胞呈长梭形,生长良好且三系分化染色呈阳性结果.浸提液组与正常干细胞培养基组的OD值无显著差异.微球复合细胞组的OD值显著高于单纯细胞培养组.激光共聚焦显微镜结果显示微球复合细胞5d后细胞大量增殖,形态良好.结论 明胶多孔微球能够促进脂肪间充质干细胞增殖且无明显毒性,具有良好的细胞相容性,为进一步体内实验奠定了基础.

目的 研究新型唑来膦酸-纳米微球(ZOL-NPs)多孔钛合金支架的构建方法及其载药释放规律.方法 采用计算机辅助设计和电子束熔融(CAD/EBM)技术制备多孔钛合金支架,采用改良二次凝聚法制备明胶纳米微球,复合唑来膦酸、明胶纳米微球、多孔钛合金支架构建ZOL-NPs多孔钛合金支架,并进行生物力学、载药量、载药释放测试.结果 制备的明胶纳米微球在水溶液中粒径为(269.5±84.6)nm,粒径表现呈正态分布.扫描电子显微镜下观察到ZOL-NPs均匀复合于支架表面及孔隙内.ZOL-NPs多孔钛合金支架的弹性模量为1.85 GPa,总载药量为(0.285±0.038) μmol,载药率为71.3％.ZOL-NPs多孔钛合金支架第1天体外药物释放量达到总载药量的10％左右,第2天开始药物释放量趋于平稳,缓慢均匀释放,第2天至第28天释放总载药量的29％左右,药物释放周期超过1个月.结论 新型ZOL-NPs多孔钛合金支架有效解决了普通金属置人物弹性模量与人体不匹配的问题,载药率高,具有良好体外缓释作用.

背景:磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性和骨传导性及可降解性,可用于修复骨缺损,但单一的磷酸钙骨水泥脆性大,不具有骨诱导活性,生物活性差.目的:构建多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥,分析其理化特性.方法:提取兔骨基质明胶,制作聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic)acid,PLGA]空白微球,将PLGA微球(质量分数分别为0,5％,10％,对应制作的骨水泥分别设为空白组、5％组、10％组)、骨基质明胶与磷酸钙骨水泥复合,构建多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥,考察3种复合骨水泥的微观结构、凝固时间、可注射性、抗溃散性、孔隙率及降解特性.将骨髓间充质干细胞分别与3种复合骨水泥浸提液共培养,14 d内检测细胞增殖率.将3种复合骨水泥材料分别植入新西兰兔腰椎椎体骨缺损内,12周后采用Micro-CT分析材料对骨缺损的修复作用.结果与结论:①与空白组比较,5％组、10％组复合骨水泥凝固时间减少(P<0.05),孔隙率增大(P<0.05),抗压强度、弹性模量降低(P<0.05),可注射性变差,抗扩散性弱,体外降解加速;与5％组比较,10％组复合骨水泥凝固时间减少(P<0.05),孔隙率增大(P<0.05),抗压强度、弹性模量降低(P<0.05),抗扩散性弱,体外降解加速;②与空白组复合骨水泥比较,5％组、10％组复合骨水泥可促进骨髓间充质干细胞的增殖(P<0.05);③3种骨水泥材料植入12周后的Micro-CT显示,骨缺损处均有新骨生成,5％组、10％组兔骨缺损部位骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量均明显高于空白组(P<0.05),骨小梁分离度均低于空白组(P<0.05);④结果表明质量分数为5％PLGA微球与骨基质明胶、磷酸钙骨水泥复合构建的骨水泥,具有良好的力学强度、降解性能、可操作性、细胞相容性及骨诱导活性.

背景:利用缓释技术将成血管基因转染至细胞是组织工程骨充分血管化的关键,而选择安全有效的基因载体至关重要.目的:制备超顺磁性壳聚糖纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIOCN)与超顺磁场壳聚糖质粒明胶微球(superparamagnetic chitosan plasmid gelatin microspheres,SPCPGM),并对其进行表征.方法:利用脱水缩合反应制备SPIOCN,对其分子结构、形态和粒径、饱和磁化强度、ζ电位及DNA结合能力进行表征.将SPIOCN溶液与成骨肉瘤细胞MG-63共孵育24 h,采用透射电镜观察细胞吞噬SPIOCN的过程.制备SPCPGM与非磁性壳聚糖明胶微球,将其填入人工多孔骨植入体中,在37℃的PBS(pH=7.4)中进行体外药物溶出实验,采用振荡磁场干预,测定质粒释放量.取成骨肉瘤细胞MG-63及人脐静脉内皮细胞HUVEC-1,分4组转染,PolyMag200(商业化磁转染试剂)/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pDNA质粒组(对照组),转染24 h后,利用倒置荧光显微镜与流式细胞仪检测转染效果.将人脐静脉内皮细胞HUVEC-1分4组培养,PolyMag200/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pDNA质粒组(对照组),培养24,48,72 h后检测细胞存活率.结果与结论:①SPIOCN的平均粒径为(187±24)nm,饱和磁化强度为(20.3±4.5)emu/g,ζ电位为(9.5±2.4)mV,具有结合保护质粒DNA转染MG-63细胞及HUVEC-1细胞的能力;②SPIOCN贴附细胞膜后,通过胞膜内吞作用进入细胞,细胞浆内可见散布吞噬SPIOCN的内涵体;③在磁场干预下,SPCPGM多孔骨植入体的质粒释放量明显高于非磁性壳聚糖明胶微球多孔骨植入体(P<0.05);④转染MG-63或HUVEC-1细胞后,PolyMag200/pDNA+静磁场组转染效率高于其余3组(P<0.05),SPIOCN/pDNA+静磁场组高于SPIOCN/pDNA组及对照组(P<0.05);⑤与对照组比较,SPIOCN/pDNA+静磁场组、PolyMag200/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率降低(P<0.05),而SPIOCN/pDNA组细胞存活率无明显变化;SPIOCN/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率高于PolyMag200/pDNA+静磁场组(P<0.05);⑥结果表明,SPIOCN具有粒径小、分散性好、毒性低、超顺磁性及结合保护DNA转染细胞的特点,振荡磁场联合SPCPGM是一种较理想的缓释基因载体系统.

目的 构建BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统,与诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)来源MSCs复合种植至羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)/二氧化锆(zirconium dioxide,ZrO2)生物多孔泡沫陶瓷材料,体外共培养,探索缓释系统对iPS-MSCs成骨分化的作用.方法 运用油包水相溶液制备BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶微球,检测微球的药物包封率、载药率和体外缓释速率.建立HA/ZrO2多孔生物泡沫陶瓷材料复合iPS-MSCs及BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统共培养体系,作为实验组;以未复合BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统的细胞-支架复合物作为对照组.两组培养3、7、10、14d,检测细胞的ALP分泌量,RT-PCR检测核心结合因子α1 (core binding factor α1,Cbfa1)、Ⅰ型胶原和锌指结构转录因子(Osterix,OSX)基因表达水平;培养14d时行免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原表达,并通过扫描电镜观察细胞爬行及黏附状态.结果 BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统具有较好的药物包封率及载药率,可延长BMP-2的活性时间.共培养体系体外培养各时间点实验组ALP分泌量及Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSX基因相对表达量均显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学染色观察示,实验组荧光数量明显多于对照组,即Ⅰ型胶原表达水平高于对照组;细胞能较均匀地分布于材料上,细胞形态良好.扫描电镜观察示缓释系统能较好地黏附于细胞之间.结论 iPS-MSCs具有促成骨分化能力,在BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统作用下其促成骨能力显著增强.iPS-MSCs与缓释系统结合后能良好黏附于材料上,且细胞活性较好.