本研究通过扫描电子显微镜观察了表面附着及未附着黏液、受精及未受精和不同孵化时间下扬子鳄(Alligator sinensis)卵的卵壳及卵壳膜超微结构.结果发现,表面附着和未附着黏液、受精或未受精扬子鳄卵的卵壳外表面均具有贯通的不规则孔隙通道,近似同心圆排列,并呈阶梯状分层下陷,部分孔隙中可见堵塞物,可能是由于表面黏液覆盖.表面黏液可减少卵内水分蒸发及腐蚀坑和凹陷的产生.不同孵化时间的扬子鳄受精卵卵壳外表面也具有分布不均的不规则孔隙和阶梯状的腐蚀坑,随着孵化时间的延长,受精卵卵壳外表面可膨胀并在孵化第30天观察到大量裂纹,卵壳外表面的孔隙和裂纹可提高卵壳的气体通透性,促进胚胎发育.受精及未受精的扬子鳄卵壳内表面可见较多排列不规则的乳突,乳突间存在孔隙,在孵化0～30d内,受精卵内表面孔隙度随时间延长逐渐增加,而内表面乳突面积逐渐减小.表面附着或未附着黏液、受精或未受精的扬子鳄卵卵壳膜结构中均可见排列随机且稀疏的网格状角蛋白纤维,纤维上有较多芽状突起.表面附着或未附着黏液卵、受精或未受精卵的卵壳膜纤维直径和孔隙度总体差异均不显著.在孵化0～30d内,受精卵卵壳膜纤维直径随时间延长的变化不大,纤维间孔隙度略有增大.纤维结构可使卵壳膜具有良好的延展性和拉伸性,在扬子鳄卵孵化过程中起保护作用.

目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.

目的 建立α1A-肾上腺素能受体(α1A-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞.方法 ① 将pcDNA3.1-α1A-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFP-NFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L-1 压力筛选后加入α1A-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10 μmol·L-1)孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2 核转位,筛选得到稳定表达α1A-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞.②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α1A-AR mRNA和蛋白的表达水平.③将U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10-8～10-5 mol·L-1)或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10-8.8～10-5 mol·L-1)孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2 核转位.④将U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1 μmol·L-1)组、NE(1 μmol·L-1)组、萘派地尔+NE(各1 μmol·L-1共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1 μmol·L-1)组、DMED(0.1 μmol·L-1)组、阿替美唑+DMED(各0.1 μmol·L-1 共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1 μmol·L-1 与 DMED 0.1 μmol·L-1共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α1A-AR功能的特异性.结果 ①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞,NE 10 μmol·L-1孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α1A-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞.②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞可明显表达α1A-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α1A-AR蛋白表达.RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5～20代内α1A-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500～800倍.③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数有效浓度(EC50)分别为5.94×10-7和6.15×10-8 mol·L-1.④与溶剂对照组和萘派地尔组比较,NE组U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),而萘派地尔+NE组EGFP-NFAT2核转位较NE组明显减弱(P<0.01).与溶剂对照组和阿替美唑组比较,DMED组EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),阿替美唑+DMED组EGFP-NFAT2核转位与DMED组比较无明显差别,而萘派地尔+DMED组EGFP-NFAT2核转位较DMED组明显减弱(P<0.01).结论 成功构建稳定共表达α1A-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α1A-AR细胞,可用于靶向α1A-AR化合物筛选和受体分子机制研究.

旨在探讨哌立福新对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及其作用机制。本研究通过24孔板静置孵育24 h培养铜绿假单胞菌生物膜，再通过结晶紫染色法检测哌立福新对铜绿假单胞菌培养基底部生物膜的抑制作用，将未加哌立福新的孔设置为对照组；通过玻璃试管静置孵育24 h构建气-液交界面生物膜，并通过结晶紫染色法检测哌立福新对铜绿假单胞菌气-液交界面生物膜形成的影响，将未加哌立福新的孔设置为对照组；将铜绿假单胞菌重悬于含有系列浓度的哌立福新培养基中，置于恒温摇床，连续检测其生长浊度随时间的变化，绘制时间-生长曲线，检测哌立福新对铜绿假单胞菌浮游菌增殖的影响，将未加哌立福新的孔设置为对照组；通过分子对接中的Glide超精确模式将哌立福新与PqsE蛋白进行柔性对接，预测哌立福新与靶蛋白PqsE的结合力及结合模式；通过检测PqsE蛋白的催化底物硫醇的生成量，验证哌立福新对PqsE蛋白催化功能的抑制能力，将未加哌立福新的孔设置为对照组；最后，通过等离子表面共振试验，验证哌立福新与PqsE蛋白的结合能力。结果显示，与未加哌立福新的对照组相比较，4~8 μg/ml的哌立福新可有效抑制铜绿假单胞菌培养基底部和气-液交界面生物膜的形成；哌立福新对铜绿假单胞菌浮游菌的增殖无影响；分子对接试验提示哌立福新与PqsE蛋白具有良好的结合力，对接分数为-10.67 kcal/mol；哌立福新还能有效抑制PqsE蛋白的催化功能，与未加哌立福新的对照组相比，随着哌立福新浓度增高，PqsE蛋白酶受抑制程度越高；通过等离子表面共振试验发现PqsE蛋白与哌立福新具有良好的结合能力，且其结合常数为6.65×10 -5 mol/L。综上，哌立福新可结合PqsE蛋白，干扰PqsE蛋白的催化功能并能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。

目的:探讨微小RNA(miR)-193b-3p在新生脓毒症大鼠海马组织中的表达情况，以及其在脓毒症神经炎症反应中的作用及可能机制。方法:将24只2 d龄SD大鼠按随机数字表法分为对照组与脂多糖组及阴性对照组与miR-193b-3p组，每组6只。脂多糖组、阴性对照组及miR-193b-3p组通过腹腔注射脂多糖(2.5 mg/kg)制备脓毒症模型，miR-193b-3p组和阴性对照组分别于脂多糖注射前3 d将5 μL miR-193b-3p模拟物或阴性对照物(20 nmol/L)注入大鼠侧脑室。将PC12细胞分为对照组、脂多糖组、miR-193b-3p组和脂多糖+miR-193b-3p组，其中miR-193b-3p组和脂多糖+miR-193b-3p组将miR-193b-3p模拟物转染入细胞内，脂多糖组和脂多糖+miR-193b-3p组细胞暴露于100 ng/mL脂多糖中孵育。采用基因芯片检测及双荧光素酶报告分析方法明确miR-193b-3p的靶基因。采用神经行为学评分评估各组大鼠特定时间点的神经功能，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组大鼠海马组织或各组PC12细胞中 miR-193b-3p及炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA的表达，采用免疫荧光双标染色检测各组大鼠海马组织中视黄酸受体相关孤儿受体α(RORα)与神经元特异性核蛋白(NeuN)、离子钙接头蛋白-1(IBA-1)或胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的共表达情况，采用免疫荧光染色检测各组PC12细胞中RORα的荧光强度。 结果:(1)基因芯片检测及双荧光素酶报告分析确定 RORα为miR-193b-3p的靶基因。(2)与对照组相比，脂多糖组大鼠的神经行为学评分自脂多糖注射后6 h开始明显降低，24 h时达最低，差异均有统计学意义( P<0.05)。与对照组相比，脂多糖组大鼠海马组织中 IL-1β、 IL-6、 TNF-α mRNA的表达均明显升高， miR-193b-3p的表达明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。(3)与阴性对照组[(3.23±0.92)分]相比，miR-193b-3p组大鼠脂多糖注射后48 h的神经行为学评分[(7.51±0.84)分]明显增高，差异有统计学意义( P<0.05)。与阴性对照组相比，miR-193b-3p组大鼠海马组织中 IL-1β、 IL-6、 TNF-α mRNA的表达均明显降低， miR-193b-3p的表达明显增高，差异均有统计学意义( P<0.05)。(4)与对照组相比，脂多糖组大鼠海马组织中NeuN(+)RORα(+)细胞数量明显减少，差异有统计学意义( P<0.05)；与阴性对照组相比，miR-193b-3p组大鼠海马组织中NeuN(+)RORα(+)细胞数量明显增加，差异有统计学意义( P<0.05)。(5)与对照组相比，脂多糖组PC12细胞中RORα的荧光强度明显降低， IL-1β、 IL-6、 TNF-α mRNA的表达均明显升高，差异均有统计学意义( P<0.05)；与脂多糖组相比，脂多糖+miR-193b-3p组PC12细胞中RORα的荧光强度明显增加， IL-1β、 IL-6、 TNF-α mRNA的表达均明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:miR-193b-3p通过调控其靶基因 RORα在海马神经细胞中的表达，抑制新生脓毒症大鼠的神经炎症反应。

目的:探讨通过外泌体靶向运载整合素αv/β3小干扰(si)RNA(si-αv/β3)对未分化甲状腺癌(ATC)细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测整合素αv/β3在ATC细胞系(8505C、Hth7)及人正常甲状腺细胞(上海生命科学院细胞所)中的表达；将含内化精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(iRGD)的质粒转染人源胚胎肾细胞HEK-293T后采用超高速离心法得到靶向外泌体，采用PKH26染色验证其靶向性；进一步通过转染获得靶向运载si-αv/β3的外泌体iRGD-exos-si-av/β3(载siRNA组)，将其同8505C细胞共孵育后，采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot检测载siRNA组与空载外泌体组8505C细胞内整合素αv/β3的mRNA和蛋白表达水平。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕实验和Transwell检测8505C细胞的增殖、迁移及侵袭能力。两样本间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:整合素αv/β3在8505C及Hth7细胞中的表达量显著高于人正常甲状腺细胞(αv：1.04±0.12、0.90±0.11比0.31±0.01， F＝50.11， P<0.01；β3：0.93±0.23、0.89±0.16比0.33±0.27， F＝6.81， P<0.05)。iRGD靶向外泌体在细胞中的荧光信号明显高于非靶向外泌体组(47.18±10.39比5.64±1.43， t＝6.86， P<0.05)。转染si-αv/β3至8505C细胞后，mRNA水平表达显著低于对照组(αv：0.20±0.01比1.21±0.14， t＝12.49， P<0.05；β3：0.21±0.02比1.01±0.18， t＝7.90， P<0.05)；蛋白表达水平亦显著低于对照组(αv：0.45±0.03比0.88±0.06， t＝10.33， P<0.05；β3：0.48±0.09比1.10±0.11， t＝9.02， P<0.05)。iRGD-exos-si-av/β3与空载外泌体组分别与8505C细胞共孵育后，前者mRNA水平表达明显低于空载组(αv：0.30±0.08比1.05±0.02， t＝16.75， P<0.05；β3：0.27±0.05比1.29±0.20， t＝8.71， P<0.05)；蛋白水平表达亦低于对照组(αv：0.60±0.30比1.20±0.23， t＝5.72， P<0.05；β3：0.24±0.11比1.26±0.14， t＝16.23， P<0.05)。载si-αv/β3的靶向外泌体组的细胞增殖率在不同时间点均明显低于空载组[载si-αv组：12 h，(1.84±0.34)%比(3.86±0.47)%， t＝6.07， P<0.05；24 h，(2.70±0.28)%比(6.52±0.29)%， t＝15.99， P<0.05；48 h，(3.62±0.25)%比(8.93±0.15)%， t＝31.16， P<0.05；载si-β3组：12 h，(2.07±0.15)%比(3.86±0.15)%， t＝6.35， P<0.05；24 h，(3.48±0.10)%比(6.52±0.29)%， t＝16.98， P<0.05；48 h，(3.85±0.22)%比(8.90±0.15)%， t＝32.62， P<0.05]。划痕24 h和48 h载si-αv/β3的靶向外泌体组的细胞迁移率均低于空载组[24 h：载si-αv组为(13.00±1.10)%比(36.00±4.00)%， t＝9.60， P<0.01；载si-β3组为(7.00±1.60)%比(36.00±4.00)%， t＝11.34， P<0.01；48 h：载si-αv组为(17.00±1.20)%比(65.00±2.50)%， t＝28.89， P<0.01；载si-β3组为(22.00±1.80)%比(65.00±2.50)%， t＝24.01， P<0.01]。载si-αv/β3组的细胞迁移数均低于空载组[载si-αv组：(3 361.67±860.52)个比(7 620.67±1 008.46)个， t＝5.56， P<0.05；载si-β3组：(2 868.33±1 499.92)个比(7 620.67±1 008.46)个， t＝4.55， P<0.01]。 结论:iRGD靶向外泌体运载si-αv/β3通过下调ATC细胞中整合素αv/β3的表达有效减弱其增殖、迁移和侵袭能力。

目的:探讨严重烧伤小鼠肠-胰岛轴功能的变化及其作用。方法:该研究为实验研究。将90只雄性8~10周龄C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为假伤组和烧伤组（每组45只小鼠），于烧伤组小鼠背部制备30%体表总面积Ⅲ度烫伤（以下称烧伤）创面，假伤组小鼠模拟致假伤。伤后24 h，检测空腹血糖（样本数为12）后，行腹腔糖耐量实验和口服糖耐量实验，并绘制血糖浓度-时间变化曲线，计算曲线下面积（样本数为6）；分别于腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液前及腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液后30、60、120 min从心脏取血，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血浆胰岛素和胰高血糖素样肽1（GLP-1）水平（样本数为3）；取每组3只小鼠回肠组织，行免疫荧光染色及原位末端标记染色检测肠道L细胞GLP-1表达及凋亡水平；提取每组6只小鼠胰岛行葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，分别经低糖（2.8 mmol/L葡萄糖）和高糖（16.7 mmol/L葡萄糖）孵育后取上清液，采用ELISA法检测胰岛素水平。取36只雄性8~10周龄C57BL/6J小鼠，按随机数字表法分为假伤组、烧伤组和烧伤+艾塞那肽4（Ex-4）组（每组12只小鼠），对假伤组和烧伤组小鼠行同前对应处理，将烧伤+Ex-4组小鼠同烧伤组小鼠致伤后给予其GLP-1受体激动剂Ex-4。伤后24 h，提取小鼠胰岛，采用蛋白质印迹法检测重链结合蛋白（BIP）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、磷酸化PERK（p-PERK）、真核翻译起始因子2α（eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的蛋白表达并计算p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α比值（样本数为3），采用流式细胞术检测胰岛细胞凋亡率（样本数为3），同前行葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验以检测上清液中胰岛素水平（样本数为6）。结果:伤后24 h，烧伤组小鼠空腹血糖为（7.3±1.0）mmol/L，显著高于假伤组的（5.1±0.6）mmol/L（ t=6.36， P<0.05）。伤后24 h，在腹腔糖耐量实验和口服糖耐量实验中，烧伤组小鼠血糖浓度-时间变化曲线下面积均显著大于假伤组（ t值分别为4.32、6.03， P<0.05）；与假伤组相比，烧伤组小鼠经腹腔注射给予葡萄糖溶液前血浆胰岛素水平及经腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液前血浆GLP-1水平均显著降低（ P<0.05），经腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液后30、60、120 min血浆胰岛素水平及经灌胃给予葡萄糖溶液后30、60 min血浆GLP-1水平均显著降低（ P<0.05）。伤后24 h，与假伤组相比，烧伤组小鼠肠道L细胞GLP-1表达水平显著降低（ t=7.74， P<0.05），凋亡水平显著升高（ t=14.28， P<0.05）。伤后24 h，烧伤组小鼠经高糖孵育的胰岛上清液中胰岛素水平为（8.5±0.4）ng/mg，显著低于假伤组的（15.7±0.3）ng/mg（ t=18.68， P<0.05）。伤后24 h，与假伤组相比，烧伤组小鼠胰岛中BIP、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α和CHOP的蛋白表达水平均显著升高（ P<0.05）；与烧伤组相比，烧伤+Ex-4组小鼠胰岛中BIP、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α和CHOP的蛋白表达水平均显著降低（ P<0.05）。伤后24 h，烧伤组小鼠胰岛细胞凋亡率为（32.0±3.0）%，显著高于假伤组的（10.3±2.5）%（ P<0.05）；烧伤+Ex-4组小鼠胰岛细胞凋亡率为（20.0±3.6）%，显著低于烧伤组（ P<0.05）。伤后24 h，烧伤组小鼠经高糖孵育的胰岛上清液中胰岛素水平显著低于假伤组（ P<0.05），烧伤+Ex-4组小鼠经高糖孵育的胰岛上清液中胰岛素水平显著高于烧伤组（ P<0.05）。 结论:严重烧伤后小鼠肠-胰岛轴功能障碍，肠道L细胞凋亡增多、GLP-1合成及分泌减少，胰岛细胞发生内质网应激、凋亡增多，葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少；GLP-1受体激动剂Ex-4能保护严重烧伤小鼠胰岛细胞功能，可能通过减轻内质网应激降低胰岛细胞凋亡水平，促进胰岛素分泌。

目的:观察大鼠多系分化持续应激(Muse)细胞对肠上皮细胞间紧密连接结构的保护作用。方法:贴壁筛选法自大鼠(6只，购自中国食品药品检定院)股骨内分离大骨髓间充质干细胞(BMMSCs)，长时间胰蛋白酶孵育法(LTi)自BMMSCs中分离大鼠Muse细胞，流式细胞术标记如白细胞分化抗原(CD)29、CD34、CD90等及特异阶段胚胎抗原-3(SSEA-3)抗体；免疫组织化学法标记Nanog同框蛋白(NANOG)等抗体，定向诱导分化后标记α-甲胎蛋白(AFP)等鉴定其多能分化能力；重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)建立体外肠上皮细胞损伤损伤模型；与Muse细胞共培养后检测细胞增殖能力及桥接蛋白-1(ZO-1)的表达水平及形态，组间比较采用 t检验。 结果:LTi后，大鼠BMMSCs中(2.57±0.57)%能够形成特征性的Muse细胞簇；流式细胞术结果表明，Muse细胞保留了BMMSCs表面分子特征，SSEA-3的阳性细胞比例[(73.2±1.4)%]显著高于BMMSCs[(2.3±0.3)%]；免疫荧光实验表明，培养的Muse细胞阳性表达NANOG等多能分化标记，定向诱导分化后分别能够表达AFP等分化标记；Muse细胞与TNF-α炎症损伤的肠上皮细胞共培养后，其增殖细胞比例[(40.06±1.04)%]高于损伤[(23.10±2.05)%]组的细胞( t＝12.79， P<0.05)及ZO-1蛋白的相对表达水平(0.55±0.03、0.27±0.01， t＝13.03， P<0.05)。 结论:大鼠Muse细胞具有更加理想的保护炎症损伤肠上皮细胞紧密连接结构的作用。

目的:探讨瑞芬太尼对BV-2小胶质细胞沉默调节蛋白2（silent information regulator 2, SIRT2）及炎症因子的影响。方法:将培养的BV-2小胶质细胞分为4组（每组1孔）：空白对照组（C组）、瑞芬太尼10 μmol/L组（R1组）、瑞芬太尼50 μmol/L组（R2组）、瑞芬太尼100 μmol/L组（R3组），待细胞基本贴满板底后，R1组、R2组、R3组分别将培养液更换为单纯DMEM/F12培养液配置的瑞芬太尼2 ml（R1组瑞芬太尼10 μmol/L、R2组瑞芬太尼50 μmol/L、R3组瑞芬太尼100 μmol/L），孵育2 h。另取培养的BV-2小胶质细胞分为4组（每组1孔）：空白对照2组（C2组）、15 min组（T1组）、1 h组（T2组）、2 h组（T3组），待细胞基本贴满板底后，T1组、T2组、T3组将培养液更换为单纯DMEM/F12培养液配置的100 μmol/L瑞芬太尼2 ml（T1组刺激15 min、T2组刺激1 h、T3组刺激2 h）。Western blot法检测各组细胞SIRT2、离子钙接头蛋白1（ionized calcium binding adaptor molecule 1, Iba1）水平，ELISA法检测各组细胞TNF-α、IL-1β水平。结果:与C组比较：R1组、R2组、R3组Iba1、IL-1β、TNF-α增加（ P<0.05），SIRT2水平降低（ P<0.05）。与R1组比较：R2组、R3组Iba1、IL-1β水平增加（ P<0.05），R3组SIRT2水平降低、TNF-α水平增加（ P<0.05）。与R2组比较：R3组SIRT2水平降低（ P<0.05）。与C2组比较：T1组、T2组、T3组Iba1、IL-1β、TNF-α水平增加（ P<0.05），SIRT2水平降低（ P<0.05）。与T1组比较：T2组、T3组Iba1、IL-1β、TNF-α水平增加（ P<0.05），SIRT2水平降低（ P<0.05）。与T2组比较：T3组SIRT2水平降低（ P<0.05），IL-1β、TNF-α水平增加（ P<0.05）。 结论:瑞芬太尼可通过剂量依赖性和时间依赖性方式使BV-2小胶质细胞中的Iba1和炎症因子的表达显著增加，并显著抑制SIRT2表达，从而激活小胶质细胞。

目的:建立人真皮成纤维细胞（HDF）高糖老化模型，探讨人蜕膜间充质干细胞（dMSC）来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法:采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者（18~22岁）环切术后废弃包皮组织，分离培养获取原代HDF。取第6代HDF，按照随机数字表法分为低糖组和高糖组，分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养，10 d后取细胞，于接种后24 h，采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况；于接种后48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况；于接种后24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞增殖情况；于接种后48 h，采用脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况；于接种后24 h，采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h，采用差速高速离心法获取其外泌体，采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态，采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布，采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101（TSG101）的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h，采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF，同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组，分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50 μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100 μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果，另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF，分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p（miR-145-5p）、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D（CAMK1D）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（ PTEN基因）和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验和独立样本 t检验。 结果:接种后24 h，高糖组HDF β-半乳糖苷酶阳性染色率为（38.4±4.2）%，明显高于低糖组的（16.5±2.2）%（ t=4.65， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组（ t值分别为11.85、3.02， P<0.05或 P<0.01）。接种后24、48、72 h，高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组（ t值分别为4.13、9.90、15.12， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组（ t=3.83， P<0.05）。接种后48 h，高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群（G0/G1、S和G2/M）的占比明显低于低糖组（ t=8.74， P<0.01）。接种后24 h，高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为（37±6）个，明显少于低糖组的（74±7）个（ t=8.42， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组（ t=8.48， P<0.01）。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡，粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h，外泌体被HDF摄入胞内，主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组（ t值分别为6.36、6.10、7.76，8.92、12.17、10.74， P<0.01），高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组（ t值分别为7.92、4.82、4.72， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高（ t值分别为5.32、9.88， P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组比较，高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高（ t=5.27， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05），G2/M+S亚群占比均明显升高（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05）。分组培养24 h，与单纯高糖组相比，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量均明显增多（ t值分别为10.14、13.39 ，P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量明显增多（ t=6.27 ，P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF凋亡率均明显降低（ t值分别为3.72、5.53， P<0.05或 P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF的miR-145-5p、miR-498 mRNA表达量均明显上升（ t值分别为13.03、8.90， P<0.01），miR-503-5p mRNA表达量明显下降（ t=3.85， P<0.05）；高糖+高浓度外泌体组中HDF的CAMK1D、 PTEN基因mRNA表达量均明显低于单纯高糖组（ t值分别为8.83、5.97， P<0.01），细胞周期蛋白D1 mRNA表达量明显高于单纯高糖组（ t=4.03， P<0.05）。 结论:人dMSC来源外泌体可显著提高高糖老化HDF的增殖和迁移能力，抑制其凋亡。这可能与HDF内miR-145-5p和miR-498表达增高抑制了CAMK1D和 PTEN基因的表达及miR-503-5p表达下降促进了细胞周期蛋白D1的表达有关。