目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.

目的:建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，DAS-ELISA)检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)滴度。方法:以RSV融合前F蛋白的两种抗体AM14与D25作为捕获抗体和检测抗体，通过对其抗体浓度的优化来确定DAS-ELISA较适反应条件，并对该方法的特异性、重复性、灵敏度及适用性进行验证。结果:选择用AM14抗体作为捕获抗体，D25作为检测抗体。捕获抗体AM14较适工作浓度为20 μg/mL，检测抗体D25的稀释比例为1∶3 000。建立的DAS-ELISA与轮状病毒(rotavirus，RV)和人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3，HPIV-3)无交叉反应，且不同稀释倍数的RSV病毒进行批内与批间重复试验的变异系数(coefficient of variation， CV)均<10%；不同亚型的RSV及蛋白进行试验，均能检测到病毒滴度；检测结果与CCID 50比较，可检测的稀释倍数略高。 结论:建立了检测RSV滴度的DAS-ELISA，该方法可为实验室RSV病毒滴度检测提供依据。

患者，男，23岁，2018年10月14日因双眼视物模糊3年于外院就诊，双眼裸眼视力0.5，最佳矫正视力右眼－0.25 DS/－0.50 DC×5＝0.6，左眼矫正无助；眼压右眼13 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，左眼12 mmHg；考虑诊断为"双眼视神经病变"。图形视觉诱发电位(pattern visual evoked potential，P-VEP)检查示右眼正常，左眼异常。头颅MRI检查示左侧额叶少许脑缺血灶，双眼眼眶未见异常。未检测到线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)3个原发突变位点mtDNA11778、mtDNA14484和mtDNA3460，初步排除Leber遗传性视神经病变及压迫性视神经病变。2019年6月29日患者于广东省人民医院眼科就诊，眼前节照相示双眼晶状体前圆锥样改变(图1A，B)；眼前节光相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)检查证实双眼晶状体前圆锥(图1C，D)。角膜地形图检查示双眼角膜偏薄，右眼瞳孔中心、顶点和最薄点厚度分别为471、470和466 μm，左眼分别为471、471和466 μm，最薄点均在颞下方，角膜前表面和后表面较规则，两子午线曲率差异在正常范围(图1E，F)。右眼角膜内皮细胞计数和六边形细胞比例分别为2 683.7个/mm 2和61%，左眼分别为2 552.7个/mm 2和70%。彩色眼底照相可见双眼黄斑周围点状色素改变(图2A，B)；OCT血流成像(OCT angiography，OCTA)示双眼黄斑无血管区(foveal avascular zone，FAZ)不规则；右眼黄斑旁鼻侧、颞侧、上方和下方视网膜浅层毛细血管密度分别为51.5%、46.3%、46.0%和44.1%，左眼分别为53.9%、51.3%、51.2%和50.6%；右眼鼻侧、颞侧、上方和下方黄斑旁视网膜厚度分别为321、242、275和253 μm，左眼分别为291、238、268和247 μm。双眼黄斑颞侧视网膜明显变薄，主要累及内层(图2C，D)。听力检测：右耳音平均听阈54 dB，骨导纯音平均听阈52 dB，左耳音平均听阈56 dB，骨导纯音平均听阈54 dB，提示双侧感音神经性耳聋。结合患者病史经查阅文献后初步考虑为Alport综合征。2019年7月11日尿常规检测显示红细胞148个/μl、血尿(++)、蛋白尿(+)；尿渗透压+尿位相结果示尿红细胞总数明显升高，为49 500个/ml；尿蛋白定量为0.8 g/24 h。2019年7月25日于肾内科行右侧肾脏穿刺活检术，苏木精－伊红染色和特殊染色三项(PAS、PASM和Masson染色)显示部分肾小球球性硬化，肾小球系膜细胞和基质轻度增生伴局灶内皮细胞增生，基底膜略增厚，毛细血管襻基底膜染色不均一，少数肾小球球囊周纤维化，其内毛细血管襻缺血皱缩，肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，多灶状及片状萎缩，肾间质可见较多泡沫样细胞，多灶状及片状炎症细胞浸润伴纤维化，小动脉管壁增厚，管腔狭窄；刚果红、氧化刚果红、油红O染色均呈阴性(图3A~D)；免疫荧光未见免疫复合物沉积；α1阳性对照正常；α3肾小球基底膜、肾小管基底膜表达缺失；α5肾小球包曼氏囊表达节段性缺失，肾小球基底膜、肾小管基底膜表达缺失(图3E~G)；电子显微镜检查结果示，肾小球基底膜厚薄不一，基底膜致密层增厚，部分呈撕裂状和蛛网状，足突弥漫融合，未见电子致密物沉积(图3H~J)。明确诊断：Alport综合征。患者尿蛋白/肌酐比明显上升，尿白蛋白增加，经过控制血压(苯磺酸氨氯地平片10 mg，每天1片)和护肾治疗(复方α-酮酸片，每次4片和尿毒清颗粒，每次5 g，均为每天3次)后尿蛋白/肌酐比和尿白蛋白均有下降。目前继续控制血压和护肾治疗，定期门诊复诊。

目的:构建并验证预测胰十二指肠切除术后患者发生临床相关术后胰瘘（CR-POPF）的集成机器学习模型。方法:本研究为预测模型研究。回顾性收集2020年6月至2023年5月在华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科接受胰十二指肠切除术的421例患者的临床资料。其中男性241例（57.2%），女性180例（42.8%），年龄（59.7±11.0）岁（范围：12~85岁）。通过分层随机抽样法将研究对象按照3∶1的比例分为训练集（315例）和测试集（106例）。使用递归特征消除算法对特征进行筛选，运用9种机器学习算法分别建模，挑选拟合能力较优的三组模型，通过Stacking算法进行模型融合构建集成模型。通过多种指标评估模型性能，并使用Shapley Additive Explanations（SHAP）方法对最优模型进行可解释性分析。根据替代胰瘘风险评分系统（a-FRS）的预测概率（P）将测试集患者分为不同风险组，对a-FRS评分进行验证并比较其与所建模型的预测效能。结果:421例患者中，发生CR-POPF 84例（20.0%）。在测试集中，Stacking集成模型表现最佳，其受试者工作特征曲线的曲线下面积（AUC）为 0.823，准确率为0.83，F1分数为0.63，Brier 得分为0.097。SHAP总结图显示，影响胰十二指肠切除术后发生CR-POPF的前9位因素依次为胰管直径、CT值比值、术后血清淀粉酶、IL-6水平、体重指数、手术时间、术前术后白蛋白差值、降钙素原及IL-10。各个因素对胰十二指肠切除术后CR-POPF 发生的影响均呈现出复杂的非线性关系。当胰管直径<3.5 mm、CT 值比值<0.95、术后血清淀粉酶浓度>150 U/L、IL-6 水平>280 ng/L、手术时间>350 min、白蛋白降低超过10 g/L时，发生CR-POPF的风险增加。a-FRS在测试集中的AUC为0.668，预测效能低于Stacking集成机器学习模型。结论:本研究构建的Stacking集成机器学习模型能够预测胰十二指肠切除术后CR-POPF的发生，有潜力成为胰十二指肠切除术后个性化诊疗的有效工具。

目的:评价重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc）治疗由药物引起的中毒性表皮坏死松解症（TEN）的疗效及安全性。方法:2009—2018年于苏州大学附属第二医院等8个中心纳入22例TEN患者，男10例、女12例，年龄22 ~ 75岁。采用rhTNFR：Fc 25 mg/次皮下注射治疗，首剂加倍，每3天1次，连续治疗6 ~ 8次。治疗前及治疗后第4、7、10、13、16、19、22、25天评估患者药疹面积和严重程度指数（DASI）评分、DASI改善指数（DASI50、DASI75、DASI90）；微量样本多指标流式蛋白定量技术检测外周血及疱液TNF-α水平。治疗过程中监测患者体温、皮疹变化及肝肾功能，记录不良事件。统计分析采用重复测量方差分析、配对 t检验及Pearson相关分析。 结果:22例患者中，未合并感染的20例在首次治疗后24 ~ 72 h体温停止升高，48 ~ 120 h恢复正常。22例首次治疗后24 ~ 48 h控制水疱新发，48 ~ 96 h皮肤颜色由鲜红色转为暗紫色，2周后皮损基本恢复正常。治疗2 ~ 4周，19例肝功能异常患者丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶水平恢复正常。治疗4 ~ 13 d，7例肾功能异常者肌酐、尿素氮得到控制。治疗过程中，22例患者DASI评分逐渐下降（ F = 532.81， P<0.01），从治疗前53.64 ± 8.67降至治疗25 d时的2.05 ± 1.21（ t = 26.60， P < 0.001）。治疗第10天，22例（100%）改善达DASI50；治疗第19天，22例（100%）改善达DASI75；治疗第25天，20例（90.90%）改善达DASI90。22例患者外周血TNF-α水平随治疗时间的延长逐渐降低，从治疗前（33.95 ± 27.90）ng/L降至第25天时（2.38 ± 0.79）ng/L。治疗前15例患者疱液TNF-α水平为（111.99 ± 99.41）ng/L，疱液/外周血TNF-α比值1.83 ~ 28.21。治疗前，22例患者血清TNF-α水平与DASI评分无明显相关性（ P = 0.10），15例患者疱液TNF-α水平与DASI评分呈正相关（ r = 0.59， P = 0.02）。治疗过程中未发现各种急性不良反应。22例患者均完成治疗并痊愈出院，出院后随访6个月未见复发及各种并发症。 结论:rhTNFR：Fc是治疗由药物引起的TEN有效及安全的药物。

目的:探讨一期前路病灶清除植骨融合内固定，二期后路内固定治疗颈椎化脓性脊柱炎的安全性及临床疗效。方法:回顾性分析2016年5月至2020年12月采用一期前路病灶清除植骨融合内固定联合二期后路内固定治疗颈椎化脓性脊柱炎20例患者的病历资料，男14例，女6例；年龄（60.2±12.6）岁（范围40~87岁）。术前均行血培养、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）等实验室检查，根据细菌培养及药敏试验结果指导抗生素选择及使用。术前、术后3个月及12个月随访时评估患者疼痛视觉模拟评分（visual analogue scale，VAS）、日本骨科协会（Japanese Orthopeadic Association，JOA）评分、Frankle神经功能分级，并测量颈椎前凸Cobb角、病变节段角。采用单因素重复测量方差分析进行统计分析。结果:20例患者均顺利完成手术。病原学检查提示金黄色葡萄球菌9例，链球菌4例，大肠埃希菌2例，余5例细菌培养阴性。20例患者均获得随访，随访时间为（18.3±6.7）个月。WBC、ESR、CRP术后3个月及12个月随访时均较术前明显下降（ F值分别为17.90、30.65、18.64，均 P<0.001）；术后3个月VAS评分为（1.35±0.49）分、12个月为（1.15±0.48）分较术前（4.95±1.10）分均明显降低（ F=176.12， P<0.001）；术后3个月JOA评分为（15.40±1.93）分、12个月为（16.06±1.36）分较术前（11.45±2.78）分均明显好转（ F=65.33， P<0.001）。术后即刻C 2~C 7颈椎前凸Cobb角为14.45°±4.36°、12个月为13.70°±3.15°较术前8.25°±4.36°明显增大（ F=72.54， P<0.001）。术后即刻病变节段角为3.60°±1.90°，术后12个月为2.90°±1.44°较术前-3.6°±5.2°（负值表示后凸畸形）明显增大（ F=42.49， P<0.001）。术后12个月随访时所有植骨区域均获得骨性融合。 结论:一期前路病灶清除植骨融合内固定联合二期后路固定治疗颈椎化脓性脊柱炎可有效进行椎管内减压，改善患者疼痛及神经功能，并可恢复颈椎稳定、矫正后凸畸形，临床疗效满意。

目的:比较F16和F20通道治疗1.5~2.5 cm单发上尿路结石的效率与安全性。方法:前瞻性分析武汉大学人民医院2018年12月到2020年12月满足纳入标准的138例行单通道经皮肾镜碎石取石术患者资料。其中14例患者根据排除标准被剔除研究，最终124例患者被纳入研究，F16组61例，F20组63例，所有患者均经目标盏"穹窿-盏颈"轴线进行穿刺，穿刺前行彩色多普勒超声判断，37例患者拟定穿刺路径上存在明显血管，F16组17例，F20组20例，采取避开血管的目标盏"穹窿侧边-盏颈"轴线穿刺路径，根据分组建立相应通道，利用钬激光粉碎结石。采用独立样本 t检验、 χ2检验或Fisher确切概率法比较两组患者一般情况、结石特征、术中术后指标的差异，线性回归分析手术时间与影响因素的相关性。 结果:两组患者术后血红蛋白下降，差异无统计学意义[(9.2±10.0) g/L比(8.9±8.2) g/L， t＝0.207， P>0.05]，且均未出现术中术后出血，两组患者在手术时间的差异有统计学意义[(39.2±5.1) min比(34.6±6.2) min， t＝4.564， P<0.05]，两组患者手术时间与结石CT值显著相关(F16， R＝0.424；F20， R＝0.664， P<0.01)，F16组手术时间与结石直径相关( R＝0.274， P<0.05)，F20组手术时间与结石直径无明显相关( R＝0.121， P>0.05)。 结论:F20通道相比F16通道，在处理结石时所用时间更短，效率更高，并可减少感染的风险。

例1 　女，71岁，2020年9月8日因全身红疹伴口唇黏膜破溃7 d于东部战区总医院就诊。2020年8月因右膝关节积液伴疼痛曾于外院静脉滴注地塞米松、口服头孢类药物等。9月2日因消化道出血外院予头孢尼西钠、奥美拉唑及输血等治疗，期间躯干、四肢新发红疹，口唇黏膜破溃，伴瘙痒、高热，予地塞米松、马来酸氯苯那敏、异丙嗪等治疗后热退，但皮损未见明显好转，遂至我院急诊科静脉滴注甲泼尼龙40 mg，以Stevens-Johnson综合征（Stevens-Johnson syndrome，SJS）转入皮肤科。高血压病史15年，口服苯磺酸氨氯地平片（1片/d）治疗，无过敏史。9月7日实验室检查：血红蛋白96 g/L（参考值：115 ~ 150 g/L，下同），C反应蛋白66.7 mg/L（0 ~ 8 mg/L），降钙素原0.109 μg/L（0 ~ 0.046 μg/L），脑利钠肽前体1 277 pmol/L（<106.2 pmol/L），总蛋白54.2 g/L（65 ~ 85 g/L），白蛋白28 g/L（40 ~ 55 g/L），尿素7.7 mmol/L（2 ~ 7.1 mmol/L），抗核抗体谱均阴性，补体C3、C4未见异常。生命体征平稳。皮肤科检查：口唇黏膜破溃结痂，面部、躯干、四肢弥漫暗红色丘疹、斑丘疹，部分表面黑痂（图1A、1B）。初步诊断为SJS。治疗：予单次皮下注射50 mg重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白（益赛普）及对症支持治疗。用药24 h内未见新发皮损；8 d后面部、躯干四肢皮损明显消退，遗留部分暗红色结痂（图1E、1F）。治疗期间患者血中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、总蛋白、白蛋白有回升趋势；C反应蛋白、降钙素原、脑利钠肽前体、尿素呈下降趋势。淋巴细胞计数、C反应蛋白、降钙素原、尿素治疗8 d后恢复正常。治疗期间无高热或其他并发症。治疗16 d，全身皮疹及结痂基本消退，随访至2021年5月未见复发。

目的:探讨伴血小板减少骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤-不能分类(MDS/MPN-U)患者的临床特点、诊断、治疗及预后，并进行相关文献复习。方法:选择2022年5月11日重庆市第四人民医院肿瘤血液科收治的1例67岁MDS/MPN-U男性患者为研究对象。采用回顾性分析方法，对患者病史、临床特征、实验室及辅助检查结果等临床资料进行分析。根据患者临床表现、实验室及辅助检查结果，对其进行诊断和治疗。对本例患者的随访截至2022年8月16日。以"骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤，不能分类""血小板减少""myelodysplastic/myeloproliferative neoplasm，unclassifiable""MDS/MPN-U""thrombocytopenia"为中、英文关键词，在中国知网数据库、万方数据服务知识平台及PubMed数据库中，检索伴血小板减少MDS/MPN-U文献，总结与本研究患者相关病例的诊疗资料。文献检索时间设定为上述数据库建库至2022年6月30日。本研究遵循的程序符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求，并与患者签署临床研究知情同意书。结果:①患者因"血细胞异常3个月"入院。院外多次血常规检查结果示，白细胞计数(WBC)增高、血小板计数减少，病程中曾出现血红蛋白(Hb)值降低。②入院后本例患者血常规检查结果示，WBC、中性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞计数、单核细胞绝对数、红细胞计数、Hb值、血小板计数分别为12.01×10 9/L、10.84×10 9/L、0.1×10 9/L、0.02×10 9/L、0.31×10 9/L、4.13×10 12/L、111 g/L、9×10 9/L。骨髓细胞形态学检查结果示，骨髓增生明显活跃，原始细胞占有核细胞比例为1%，粒系细胞为79%，红系细胞为19.5%；骨髓涂片全片可见巨核细胞16个；三系细胞未见明显发育异常。骨髓活组织检查结果示，骨髓有核细胞增生程度极度活跃(造血组织面积约为85%)，幼稚细胞略可见，粒/红细胞比例略增高，巨核细胞可见病态造血，考虑骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤(MDS/MPN)。骨髓细胞流式细胞术检查结果示，髓系原始细胞占全部有核细胞的0.52%，细胞表型未见明显异常。髓细胞白血病中常见25种融合基因筛查结果呈阴性。骨髓细胞荧光原位杂交(FISH)结果示， JAK2、 FGFR1、 PDGFRA、 PDGFRB重排均呈阴性。骨髓细胞染色体核型分析结果示正常核型。骨髓增殖性肿瘤(MPN)相关基因突变检测结果示，Ⅰ类变异 ASXL1 p．Gly646TrpfsTer12突变频率为41.3%， PHF6 p．Tyr301Ter突变频率为97.5%；Ⅱ类变异 CUX1 p．Gln326Ter突变频率为19.1%。③本例患者被诊断为伴血小板减少MDS/MPN-U，并予沙利度胺口服100 mg/d，长期服用。院外定期复查血常规检查，血小板计数上升(患者治疗前血小板计数<20×10 9/L)，最高达41×10 9/L。本例患者评估疗效为临床获益。截至随访结束，患者一般情况良好，无活动性出血表现。④按照本研究制定的文献检索策略，共筛选出3篇文献，纳入本研究在内4例伴血小板减少MDS/MPN-U患者，4例患者均为男性，脾大者为2例，染色体核型均为正常核型， BCR/ ABL融合基因及 JAK2V617F基因突变阴性，接受去甲基化药物、免疫调节剂、细胞毒性药物、化疗等治疗，但是疗效较差，其中1例行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)，随访18个月时疾病稳定。本例患者予沙利度胺治疗有效。 结论:伴血小板减少MDS/MPN-U罕见，患者具有高龄、原始细胞增多、相关基因突变等不良预后因素，目前无统一的治疗指南及专家共识，可选择的治疗方案有限，免疫调节剂、allo-HSCT可能有效。

目的:在小鼠中筛选和确定尼帕病毒(Nipah virus，NiV)融合糖蛋白(fusion glycoprotein，F)和附着糖蛋白(attachment glycoprotein，G)特异性的H-2 d限制性T细胞表位。 方法:本研究基于NiV F和G蛋白全序列设计合成多肽库(单肽长为15个氨基酸，前后肽重复10个氨基酸)，使用表达NiV F和G蛋白的DNA疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠，通过矩阵设计将F和G抗原全序列肽库分别混合成肽池，取免疫后小鼠脾细胞进行IFN-γ ELISPOT检测，确定肽库中特异反应的优势表位肽。结果:F肽库筛选到12条特异性优势肽，第56条多肽产生的反应最强；G肽库筛选到4条特异性优势肽，第72条多肽产生的反应最强。结论:本研究使用IFN-γ ELISPOT方法筛选和确定了12条NiV F抗原特异性和4条NiV G抗原特异性H-2 d限制性优势T细胞表位，为NiV免疫学与疫苗研究提供了参考。