目的:探讨双层蚕丝支架复合脂肪干细胞(ADSCs)构建的组织工程膀胱补片在膀胱修复重建中的效果。方法:2020年5月至2021年3月利用家蚕蚕茧获得丝素蛋白(SF)水溶液，制备由丝素蛋白膜和丝素蛋白海绵组成的双层蚕丝支架。分离培养大鼠ADSCs，并对ADSCs表面标志物(CD29、CD90、CD45、CD106)进行流式细胞鉴定。将ADSCs种植在双层蚕丝支架上构建组织工程膀胱补片。将36只雄性SD大鼠按随机数字表法分为组织工程膀胱补片组(SF-ADSCs组，15只)、双层蚕丝支架组(SF组，15只)、对照组(6只)。SF-ADSCs组和SF组分别将组织工程膀胱补片和双层蚕丝支架包埋于大鼠的大网膜，以促进移植物血管化。包埋7 d后，两组分别处死3只大鼠，行HE和免疫荧光染色检查评估血管化情况。SF-ADSCs组(12只)和SF组(12只)于膀胱顶部切除超过50%的膀胱组织，保留三角区和输尿管开口，分别采用大网膜包埋后的组织工程膀胱补片和双层蚕丝支架修补膀胱缺损；对照组在充分暴露膀胱组织后随即关闭切口。术后4周，SF-ADSCs组和SF组分别随机取6只大鼠，观察膀胱组织的大体形态，行膀胱造影检查观察膀胱壁形态，移植物取材后行HE和Masson's 3色染色、免疫荧光染色检查观察膀胱壁组织再生情况。术后12周，3组均行尿动力学检查，均行上述检查比较膀胱组织形态学、组织再生情况的差异。结果:流式细胞实验结果显示，分离的细胞阳性表达CD29和CD90，未见CD45和CD106显著表达。大体观察和扫描电镜结果证实制备的双层蚕丝支架不仅具备利于细胞种植的孔隙结构，还具备良好的韧性利于手术缝合。大网膜包裹后，SF-ADSCs组血管样结构的数量[(43.50±2.66)个]和面积占比[(0.73±0.03)%]明显高于SF组[(24.50±3.51)个，(0.55±0.05)%]，差异均有统计学意义( P<0.05)。膀胱修补术后4周，SF-ADSCs组和SF组移植物组织学染色可见大量双层蚕丝支架降解碎片；术后12周形态学检测结果显示，SF-ADSCs组移植物膀胱形态均一，与正常膀胱组织形态相近，免疫荧光染色结果表明SF-ADSCs组中可见连续的尿路上皮层、大量的平滑肌组织、血管结构和再生的神经元。尿动力学检查结果显示，SF-ADSCs组膀胱最大容积[(0.74±0.03)ml]和顺应性[(16.68±0.44)μl/cmH 2O]明显优于SF组[(0.47±0.05) ml、(14.89±0.37)μl/cmH 2O]，但低于对照组[(1.12±0.08 ml)、(19.34±0.45)μl/cm H 2O]，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:双层蚕丝支架和ADSCs构建的组织工程膀胱补片，可促进膀胱组织形态学修复、膀胱壁结构再生和膀胱生理功能的恢复。

[目的]针对蚕种培育中人工分蛹效率低且易受到主观因素影响的问题,提出一种基于纹理特征和改进VGG的家蚕Bombyx mori蛹雌雄识别方法.[方法]利用透射变换矫正蚕蛹方向,截取家蚕蛹头尾图,以B通道图作为轮廓提取的基础,通过道格拉斯-普克(Douglas-Peucker,DP)算法,分析轮廓复杂性从而识别并获取家蚕蛹尾部图;采取掩膜消除背景干扰,通过多通道的特征融合图加强纹理信息;对Inception模块进行改进,将残差网络与改进后的Inception模块加入VGG模型中;利用数据增强技术扩充数据集;以精确率(precision)、召回率(recall)、精确率和召回率的调和平均F1分值以及准确率(accuracy)作为评价指标,分别对3种输入图片以及4种识别模型进行评估对比.[结果]结果表明,特征融合图在改进VGG模型上的家蚕雌蛹的精确率、召回率和F1分值分别为98.017％,94.794％和96.375％,雄蛹的精确率、召回率和F1分值分别为95.342％,98.231％和96.762％,识别家蚕雌雄蛹的准确率为96.580％.特征融合图识别家蚕雌雄蛹的准确率比原始灰度图的提升了 18.093％,改进VGG识别家蚕雌雄蛹的准确率比原始VGG的提升了2.257％.[结论]基于纹理特征和改进VGG的家蚕蛹雌雄识别方法能降低人工劳动时间,为实现家蚕蛹雌雄自动分拣提供基础.

水平基因转移(horizontal gene transfer,HGT)是生物体获得遗传信息的方式之一,对生物体进化起重要作用.近年来,越来越多昆虫中的水平基因转移现象被报道,如在鳞翅目(如家蚕、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾)、半翅目(如柑橘粉蚧、烟粉虱)、鞘翅目(如咖啡果小蠹、米象、光肩星天牛)、膜翅目(如金小蜂)、双翅目(如果蝇、白纹伊蚊)等昆虫中广泛存在水平转移基因,且不同的水平转移基因对昆虫的营养合成与共生、吸收与消化、毒素产生与解毒、生长和发育、体色改变等方面有着重要作用.本文结合国内外专家学者的相关报道,就HGT的研究步骤与技术方法、评判HGT发生的方法、昆虫HGT的供体与功能几个方面进行了总结和讨论,以期更加深入地了解水平基因转移现象,为探究水平基因转移的作用机制、理解昆虫的进化、遗传和行为、并将水平基因转移应用到农业生产中为农业害虫的绿色防治提供更多思路.

[目的]基于粘虫Mythimna separata成虫脑转录组数据,明确粘虫体内生物胺受体基因的分子特征及组织表达特性,为粘虫生物胺受体基因的功能研究提供基础.[方法]从粘虫成虫脑转录组数据库中筛选生物胺受体基因序列;基于粘虫基因组数据库,对筛选到的生物胺受体进行基因定位;利用最大似然法对鉴定到的生物胺受体进行系统发育分析;利用qRT-PCR检测鉴定到的生物胺受体基因在粘虫雌雄成虫脑、触角、下唇须、翅、足、胸和腹中的表达量.[结果]从粘虫成虫脑转录组数据库中鉴定出17个生物胺受体基因,包括5个多巴胺受体基因、5个5-羟色胺受体基因、5个章鱼胺受体基因和2个酪胺受体基因.这17个生物胺受体基因分布于8条染色体上,其中7个受体基因共定位于22号染色体上.鉴定到的粘虫生物胺受体与斜纹夜蛾Spodoptera litura、家蚕Bombyx mori和烟草天蛾Manduca sexta生物胺受体具有较高的同源性.粘虫多巴胺受体基因均在雌雄成虫脑和触角中高表达,其中MsepDop2,MsepDop3-1,MsepDop3-2和MsepDopEcR在雌成虫脑中的表达量显著高于在雄成虫脑中的表达量;章鱼胺受体基因MsepOA1和MsepOA2B2在胸部高表达,且在雌成虫胸部中的表达量显著高于雄成虫胸部中的,MsepOA3和MsepOA2B1-3在嗅觉组织触角和下唇须中也具有较高的表达量,并且表达量具有性别差异;酪胺受体基因在脑和触角中具有较高的表达量,其中MsepTA2在雌成虫腹部中的表达量显著高于雄成虫腹部中的;Msep5-HT1基因在脑部中的表达量显著高于在其他组织中的,Msep5-HT2基因在脑、触角和下唇须中都具有较高的表达量.[结论]本研究获得了粘虫17个生物胺受体基因,明确了其在雌雄成虫不同组织中的表达模式,并发现部分生物胺受体基因在粘虫嗅觉和生殖组织中的表达具有性别差异,这为进一步研究粘虫生物胺受体的生理功能提供了基础.

本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38 的串联多聚体蛋白.利用原核表达技术获得BmSPI38 串联多聚体蛋白,并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响.活性染色结果表明,基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高 BmSPI38 蛋白的结构均一性.蛋白酶抑制实验表明,基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高 BmSPI38 对微生物蛋白酶的抑制能力.孢子萌发实验表明,His6-SPI38L-tetramer 对球孢白僵菌(Beauveria bassiana)分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer.真菌生长抑制实验显示,能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38 对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)的抑制能力.本研究成功实现 BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达,并证实可通过串联多聚体化来增强 BmSPI38 的结构均一性和抗真菌能力,不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略,还将推动BmSPI38 的外源生产及在医疗领域的应用.

跨膜p24(transmembrane emp24 domain,TMED)基因与哺乳动物的免疫反应、信号传导、生长发育和疾病发展等密切相关.然而,昆虫中仅有果蝇TMED的报道.本研究从基因组鉴定了家蚕、赤拟谷盗、烟草天蛾和意大利蜂的TMED家族基因,并发现 1 个α类、1 个β类、1 个δ类和多个γ类的TMED家族基因成员构成模式产生于膜翅目分化前昆虫的共同祖先,而果蝇类TMED家族成员构成在进化中形成了独特模式.昆虫 TMED 家族 γ 类基因进化速度较快,分化成了TMED6-like、TMED5-like和TMED3-like这 3 个独立的亚类.TMED5-like基因在膜翅目昆虫发生了丢失,在鳞翅目昆虫祖先中发生了复制,在果蝇类发生了重复.昆虫TMED蛋白除具有典型的TMED结构特征外,还有明显的信号肽.家蚕 7 个TMED基因分布在 6 条染色体上,1 个基因为单外显子,6个基因为多外显子.从幼虫组织克隆了家蚕 7个TMED基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)全序列并登录到GenBank数据库.BmTMED1、BmTMED2和BmTMED6在家蚕各个时期和组织中均表达,所有基因都在家蚕 4 龄、5 龄和丝腺组织中表达.本研究发现了昆虫的TMED家族成员构成模式、γ类分化特点以及它们的进化历史等,为进一步研究家蚕以及其他昆虫TMED基因提供了基础.

醛酮还原酶超家族(aldo-keto reductase super family,AKRs)具有广泛的底物特异性,目前尚未见对昆虫 AKR 基因家族成员的系统鉴定报道.本研究采用生物信息学手段,预测了家蚕(Bombyx mori)AKR基因的系统进化、理化性质、染色体定位、保守基序和基因结构,通过转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析了不同组织时期及不同发育状态蚕卵中BmAKR基因的表达水平,并采用Western blotting检测了蚕卵中该蛋白的表达量.本研究共鉴定出 11 个BmAKR基因,分布在 4 条不同的染色体上,都具有AKR家族特有的(α/β)8 桶保守结构,理化特征较为相似;系统进化分析显示,其可分为 2 个家族(AKR1和AKR2).转录组数据分析显示,家族成员基因在不同组织时期中的表达差异较大.进一步分析发现,一部分BmAKR基因在非滞育卵的表达量显著高于滞育卵;但BmAKR1-1在滞育卵中的表达量却显著高于非滞育卵.蛋白水平的检测发现BmAKR1-1 在滞育卵和非滞育卵的差异变化趋势与 qRT-PCR结果一致.综上所述,本研究通过对家蚕BmAKR家族的鉴定和分析,筛选出BmAKR1-1等作为调控蚕卵发育的候选基因,以便后期对其进行深入研究.

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物中分布广泛、含量丰富且作用关键的一类RNA修饰.东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae专性侵染成年蜜蜂导致微孢子病,给养蜂业造成很大损失.本研究对东方蜜蜂微孢子虫的甲基转移酶样蛋白 5(Methyltransferase-like protein 5,Mettl5)基因 NcMettl5 进行克隆,通过生物信息学预测 NcMettl5 蛋白的理化性质和分子特性,并通过RT-qPCR检测NcMettl5在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程的相对表达量,以期丰富NcMettl5的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子侵染中NcMettl5的功能及调控机制提供基础.结果表明,扩增出约 600 bp的目的片段,与GenBank数据库收录的预测出的NcMettl5序列一致;NcMettl5 的分子量约为 22.64 kDa,分子式为 C1039H1645N269O284S6,理论等电点是9.37,脂溶系数是98.98,不稳定系数为13.96;包含196个氨基酸和20个磷酸化位点;平均亲水系数为-0.230,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞骨架、细胞质和细胞核、细胞核、线粒体和过氧化物酶体;NcMettl5 含有 1 个超家族结构域:AdoMet_MTases superfamily;东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫Nosema bombycis CQ1 和颗粒病微孢子虫Nosema granulosis的Mettl5均含有 7 个相同的保守基序,序列一致性较高,且进化距离较近;NcMettl5 在东方蜜蜂微孢子虫接种后 1-4 d的意大利蜜蜂工蜂中肠内均有表达;相较于接种后 1 d(1 day post inoculation,1 dpi),NcMettl5 的表达量在 2 dpi和 3 dpi下调但差异不显著(P＞0.05),在 4 dpi显著下调(P＜0.05).研究结果表明成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫的 NcMettl5 基因,明确了 NcMettl5 蛋白的分子特性,并揭示NcMettl5 可能为亲水性蛋白、非跨膜蛋白和胞内蛋白,Nosema 属的东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫和颗粒病微孢子虫的Mettl5 蛋白具有较高的保守性,NcMettl5 在东方蜜蜂微孢子虫增殖周期内真实表达且总体呈持续下降的表达趋势.

蜕皮是许多变态发育昆虫的一种重要生理现象,昆虫通过蜕皮液中的酶对新旧表皮进行分离.已有相关蛋白组学的研究证明,家蚕蜕皮液中具有一种含量丰富的羧肽酶 A(Bombyx mori-carboxypeptidase A,Bm-CPA),目前对其作用功能尚不清楚.为了更好地了解Bm-CPA在家蚕蜕皮发育过程的作用,本研究通过生物信息学分析、实时荧光定量 PCR、抗体制备、免疫荧光染色和毕赤酵母表达等方法对Bm-CPA进行了研究.结果显示,Bm-CPA具有保守的M14 锌羧肽酶结构域和糖基化位点,并且受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)调控,在眠期和上簇期的表皮中大量表达;免疫荧光染色显示 Bm-CPA 在眠期的表皮中富集,Bm-CPA 抑制剂会导致幼虫因无法蜕皮而死亡;通过毕赤酵母表达系统在体外成功获得大量的重组 Bm-CPA 蛋白.这些结果为深入了解家蚕蜕皮发育过程提供了一定的参考.

聚焦高三遗传学教学中的"平衡致死系"问题,分别从果蝇隐性突变体的检测和家蚕育种2个应用角度进行相关问题的探讨,为教师教学和学生拓展知识提供一定的参考.