[目的]探究疏血通及其主要成分水蛭素对Sprague-Dawley(SD)大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的影响及机制.[方法]体外成熟7 d的CGNs分为存活对照组(用含K+浓度为25 mmol/L的培养基,即25 K组)、凋亡组(用含K+浓度为5 mmol/L的培养基,即5 K组)、以1/50、1/40、1/30、1/20、1/10浓度(稀释50、40、30、20、10倍)疏血通注射液处理组(25 K以及5 K合并疏血通处理组)以及对应不同浓度(2 U/mL、2.5 U/mL、3.34 U/mL、5 U/mL、10 U/mL)水蛭素处理组(25 K以及5 K合并水蛭素处理组),用Hoechst染色法观察并统计凋亡率.在蛋白印迹实验中,在25 K和5 K条件下用1/50、1/10浓度疏血通注射液以及对应2 U/mL、10 U/mL浓度水蛭素处理细胞,用West-ern blot法检测Cleaved Caspase-3、Bim、VEGF的表达水平.[结果]核染色结果显示,与25 K存活对照组比较,5 K凋亡组凋亡率增加;与25 K存活对照组比较,不同浓度疏血通注射液与水蛭素处理细胞后凋亡率无明显变化;与5 K凋亡组比较,不同浓度疏血通注射液与水蛭素处理细胞后凋亡率下降,且随着浓度的升高,凋亡率下降越明显.Western blot结果显示,与5 K凋亡组比较,不同浓度疏血通与水蛭素处理细胞后Cleaved Caspase-3、Bim蛋白表达水平均下降,VEGF蛋白表达水平升高.[结论]疏血通及其主要成分水蛭素通过抑制Bim表达,进而抑制线粒体依赖的小脑颗粒神经元凋亡.

[目的]探究共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶失活诱导神经元凋亡的具体分子机制.[方法]体外成熟7 d的小脑颗粒神经元(CGNs)分别用含25 mmol/L KCl(25 K)培养基、5 mmol/L KCl(5 K)培养基和含ATM特异性抑制剂(Ku55933,10 μmol/L;Ku60019,15 μmol/L)的25 K培养基后进行免疫印迹检测ATM、Caspase3、Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平或培养8 h后进行Hoechst染色分析.在C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA,q-PCR和免疫印迹验证其干扰效率.体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染ATM特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h后进行Hoechst染色和凋亡分析.体外成熟7 d的CGNs用含ATM特异性抑制剂的25 K培养基培养8 h后进行全转录组测序、差异表达基因鉴定和通路富集分析.体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染GADD45α特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h,用含15 μmol/L Ku6的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理 8 h后进行Hoechst染色和凋亡分析.[结果]与25 K组相比,5 K处理组和ATM特异性抑制剂处理组的CGNs ATM蛋白表达降低、Cleaved Caspase-3蛋白表达增加、细胞核固缩率增加.C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA后有效降低ATM 和GADD45α 的mRNA和蛋白的表达.与对照相比,CGNs转染ATM特异性siRNA 后,细胞核固缩率升高.在Ku55933处理组中鉴定出835个基因表达上调,848个基因表达下调;在Ku60019处理组中鉴定出454个基因表达上调,314个基因表达下调;274个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同上调,179个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同下调,其中ATM下游靶标GADD45α表达上调;通路富集结果显示TNF信号通路、NF-κB信号通路和凋亡信号通路等被显著富集.与对照相比,抑制剂处理组和5K组GADD45α的mRNA和蛋白表达均升高.与对照相比,转染GADD45α特异性siRNA后用含15 μmol/L Ku60019的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理后的CGNs细胞核固缩率降低.[结论]ATM活性降低诱导GADD45α依赖的神经元凋亡.

目的 探究海洛因致小脑颗粒细胞凋亡中c-Jun氨基端激酶(c-Jun)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白质的表达情况,分析c-Jun和Bcl-2与海洛因影响小脑颗粒细胞凋亡的关系.方法 取8只出生7d的SD大鼠小脑颗粒细胞进行体外培养,随机分为实验组(以80 mg/L海洛因干预)、抑制剂组(以80 mg/L海洛因和10 μmol/L CEP1347干预)、正常组(正常培养的小脑颗粒细胞).采用Hoechst 33258荧光染色技术检测细胞凋亡率,采用免疫荧光、Western blot检测c-Jun和Bcl-2蛋白的表达情况.结果 实验组细胞凋亡率较抑制剂组及正常组高(P＜0.05);实验组与正常组比较,c-Jun蛋白含量明显升高(P＜0.05),Bcl-2蛋白含量下调(P＜0.05);抑制剂组中c-Jun蛋白含量较实验组明显下降(P＜0.05).结论 c-Jun和Bcl-2参与海洛因致小脑颗粒神经元细胞凋亡过程,并且可能是c-Jun氨基末端激酶信号通路中的重要候选促凋亡因子.

[目的]研究抑制组蛋白去乙酰化酶成员HDAC4对SD大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的影响及机制.[方法]将原代培养6～9d的CGN分为存活对照组(用含K+浓度为25 mmol/L的培养基,即25 K组)、凋亡组(用含K+浓度为5 mmol/L的培养基,即5K组)和LMK-235处理组(5K合并LMK-235处理组),在5K条件下用不同浓度HDAC4抑制剂LMK-235处理细胞.在转染实验中,将CGN分为25 K+siNC组、5 K+siNC组、5 K+siH-DAC4-1组和5 K+siHDAC4-2组,共转染GFP标记目的细胞.用Western blot法检测p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun 的表达水平,用Hoeehst染色法观察并统计核固缩情况,用免疫荧光检测c-Jun磷酸化水平.[结果]Western blot结果显示,与5K组比较,LMK-235处理细胞后JNK、c-Jun磷酸化水平下降.核染色结果显示,与25 K组比较,5K组核固缩率明显增多(P＜0.05);与5K组比较,LMK-235处理细胞后核固缩率明显减少(P＜0.05).与5K+siNC组比较,小分子干扰HDAC4后,HDAC4的表达下调,c-Jun的磷酸化水平降低,CGNs核固缩率明显减少(P＜0.05).[结论]抑制HDAC4通过下调JNK/c-Jun活性使神经元核固缩率减少,从而抑制神经元凋亡.

目的 探讨Ras同系物(Rho)、肿瘤坏死因子(TNF-ɑ)和非受体酪氨酸激酶(C-AbI)蛋白表达在海洛因诱导大鼠小脑颗粒细胞凋亡过程中的作用表达和意义.方法 成功建立海洛因成瘾模型后继续增加海洛因用量,并分为对照组 、海洛因成瘾组 、海洛因成瘾10 d组 、海洛因成瘾20 d组 、海洛因成瘾30 d组和海洛因成瘾40 d组,通过苏木精-伊红(HE)染色 、电镜进行形态观察,凋亡试剂盒检测凋亡,免疫组织化学和免疫印迹检测TNF-ɑ 、Rho、C-AbI蛋白表达情况.结果 海洛因成瘾组大鼠小脑白质神经元细胞数目减少,结构紊乱,神经细胞内出现小空泡,多个小空泡可以合并较大腔隙;神经元细胞突起减少 、水肿,分布在毛细血管周围或神经毡内,与周围水肿的突触形成疏松的筛孔状.神经元细胞出现皱缩 、胞浆碎裂 、线粒体嵴肿胀消失 、出现断裂,空泡化,胞核体积明显缩小并变形 、核基质减少 、消失 、水肿.在海洛因成瘾(10 d、20 d、30 d、40 d)组中,神经元细胞凋亡数量随着成瘾天数延长而逐渐增多,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).在大鼠成瘾模型各组中,TNF-ɑ 和Rho蛋白随给药时间增加而逐渐增多,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而C-AbI蛋白在海洛因成瘾各组中均无明显变化,与对照组比较无明显差异(P>0.05).结论 小脑神经元细胞凋亡数量与海洛因作用时间呈正相关,TNF-α 和Rho蛋白参与了海洛因致神经元凋亡过程,C-AbI蛋白与海洛因致神经元凋亡作用关系不明显.

[目的]研究抑制共济失调毛细血管扩张突变(ATM)蛋白对SD大鼠小脑颗粒神经元(CGN)凋亡的影响及机制.[方法]将原代培养7～8 d的CGN分为25 K组、5K组和ATM抑制组.分别应用含有25和5 mmol/LKCl的培养基处理25 K组和5K组,建立体外神经元存活和凋亡模型.在25 K神经元存活模型中,应用ATM抑制剂KU-55933(10 μmol/L,ATM抑制组)、KU-55933联合MithramycinA(1μmol/L,MMA组)或Chromomycin A3(0.3 μmol/L,CMA3组)处理,用Western Blot方法检测p-ATM、ATM、Bim、Caspase 3的表达水平,用Hoechst染色法观察并统计核固缩情况.[结果]Western Blot结果显示,与25 K组比较,5K组和ATM抑制组的Bim、Caspase 3蛋白表达均上调(P＜0.05).核染色结果显示,与25K组比较,5K组和ATM抑制组核固缩率均明显增多(P＜0.05).与ATM抑制组比较,MMA组和CMA3组中Bim表达、Caspase3活性及核固缩率均明显减少.[结论]抑制ATM上调Bim活性,促进小脑颗粒神经元凋亡.

背景:二乙酰吗啡药物可导致神经元损伤,但是目前二乙酰吗啡是否诱导神经元细胞凋亡,C-jun、Cytc和Caspase-9因子是否参与此过程尚未见报道.目的:探讨C-jun、Cytc、Caspase-9是否参与二乙酰吗啡诱导神经元细胞凋亡过程.方法:将SD乳鼠小脑颗粒神经元细胞体外培养7 d,采用不同质量浓度二乙酰吗啡(0,10,40,80,100,120 mg/L)干预神经元细胞24 h,在倒置荧光显微镜下观察神经元细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率.采用100 mg/L二乙酰吗啡和20μmol/L JNK抑制剂SP600125作用于细胞24 h,通过免疫荧光和蛋白印迹方法检测C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白的表达.结果与结论:①在不同质量浓度二乙酰吗啡干预下,随着给药质量浓度的增加,神经元细胞胞体萎缩、亮度降低,部分呈灰黑色,细胞碎裂,神经元网状结构不同程度的消失,细胞改变数量逐渐增加;②随着给药质量浓度的增加,形态改变的细胞数量明显增多(P<0.01),细胞凋亡率也显著增高(P<0.01);③与对照组相比,100 mg/L二乙酰吗啡作用神经元细胞时,二乙酰吗啡组C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白呈高表达,差异有显著性意义(P<0.05);与二乙酰吗啡组相比,二乙酰吗啡+SP600125组C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白表达明显下调,差异有显著性意义(P<0.05);④结果表明,二乙酰吗啡可诱导小脑颗粒神经元细胞凋亡,C-jun、Cytc和Caspase-9参与了二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡的过程.