目的:观察RNA m6A去甲基化酶ALKBH5基因敲除之后对老年小鼠小脑形态和功能的影响，探究ALKBH5在小脑退行性病变中的作用。方法:免疫印迹实验检测不同年龄C57BL/6野生型小鼠（包括2月龄、6月龄、12月龄、18月龄）小脑中ALKBH5的蛋白水平。通过免疫组织化学实验检测中年（12月龄）及老年（18月龄）野生型小鼠和ALKBH5基因敲除（ALKBH5 -/-）小鼠中NeuN、Calbindin-D28K、MAP2、胶质纤维酸性蛋白等蛋白的表达情况。平衡木实验和步态实验检测小鼠平衡能力以及运动协调能力。 结果:ALKBH5蛋白在小脑中的表达水平随着小鼠生理性衰老的进行而逐渐升高。在中年小鼠中，野生型和ALKBH5 -/-小鼠的体重、脑重以及小脑的形态大小没有明显差别，同时颗粒神经元、浦肯野细胞及神经元树突的形态和数量均未见明显改变。在老年小鼠中，相较于野生型小鼠，ALKBH5 -/-小鼠的体重、全脑重和小脑重分别下降15%、10%和21%（ P<0.05）。ALKBH5在浦肯野细胞中的表达高于其他类型的神经细胞，与之对应在老年ALKBH5 -/-小鼠中浦肯野神经元的数量下降40%，树突的长度和密度也明显减少（ P<0.01）。老年ALKBH5 -/-小鼠通过平衡木相较于同龄的野生型小鼠所用的时间增加70%，且出现步态不稳的情况（ P<0.01）。 结论:RNA m6A去甲基化酶ALKBH5缺失会造成老年小鼠小脑萎缩、浦肯野神经元缺失与受损，进而损害其运动协调和平衡能力。上述结果提示RNA m6A甲基化失衡会导致小脑的神经退行性病变。

目的:探讨1例成人起病的神经元蜡样脂褐质沉积症7型(CLN7)患者的临床表型及基因变异特点。方法:选择2021年6月于河南省人民医院被确诊为CLN7女性患者为研究对象。采用回顾性分析方法，对该例患者的临床病例资料、辅助检查及基因检测结果进行分析。结果:患者年龄为39岁，其主要临床表现为进行性视力下降、癫痫、共济失调和轻度认知减退；其神经影像学检查结果显示以小脑为主的全脑萎缩；眼底照相显示视网膜色素变性(RP)；皮肤组织病理学活检可见腺体外周间质细胞较多的脂褐素颗粒沉积。全外显子组测序(WES)提示患者 MFSD8基因存在c.1444C>T(p.R482*)和c.104G>A(p.R35Q)复合杂合变异，其中c.1444C>T为已被文献报道的致病性无义变异，而c.104G>A为迄今尚未见报道的错义变异，Sanger测序显示患者的女儿、儿子及患者兄长分别携带c.1444C>T(p.R482*)、c.104G>A(p.R35Q)、c.104G>A(p.R35Q)变异，符合CLN7常染色体隐性遗传致病特点。 结论:本研究发现迄今发病年龄最晚的CLN7病例，临床特征为成年期起病的多系统受累，小脑萎缩及RP可进一步提示诊断， MFSD8基因的c.1444C>T(p.R482*)和c.104G>A(p.R35Q)复合杂合变异可能为该患者的遗传学病因。

[目的]探究疏血通及其主要成分水蛭素对Sprague-Dawley(SD)大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的影响及机制.[方法]体外成熟7 d的CGNs分为存活对照组(用含K+浓度为25 mmol/L的培养基,即25 K组)、凋亡组(用含K+浓度为5 mmol/L的培养基,即5 K组)、以1/50、1/40、1/30、1/20、1/10浓度(稀释50、40、30、20、10倍)疏血通注射液处理组(25 K以及5 K合并疏血通处理组)以及对应不同浓度(2 U/mL、2.5 U/mL、3.34 U/mL、5 U/mL、10 U/mL)水蛭素处理组(25 K以及5 K合并水蛭素处理组),用Hoechst染色法观察并统计凋亡率.在蛋白印迹实验中,在25 K和5 K条件下用1/50、1/10浓度疏血通注射液以及对应2 U/mL、10 U/mL浓度水蛭素处理细胞,用West-ern blot法检测Cleaved Caspase-3、Bim、VEGF的表达水平.[结果]核染色结果显示,与25 K存活对照组比较,5 K凋亡组凋亡率增加;与25 K存活对照组比较,不同浓度疏血通注射液与水蛭素处理细胞后凋亡率无明显变化;与5 K凋亡组比较,不同浓度疏血通注射液与水蛭素处理细胞后凋亡率下降,且随着浓度的升高,凋亡率下降越明显.Western blot结果显示,与5 K凋亡组比较,不同浓度疏血通与水蛭素处理细胞后Cleaved Caspase-3、Bim蛋白表达水平均下降,VEGF蛋白表达水平升高.[结论]疏血通及其主要成分水蛭素通过抑制Bim表达,进而抑制线粒体依赖的小脑颗粒神经元凋亡.

目的 通过改进已报道的新生小鼠小脑颗粒神经元培养方法,以获得纯度更高,杂质更少,状态更佳的颗粒神经元.方法 将小鼠小脑组织剪碎,经木瓜蛋白酶消化后得到单细胞悬液,采用Percoll非连续性密度梯度离心法分离出颗粒神经元前体细胞,种植在基质胶包被过的培养皿中并在培养20 h后给予阿糖胞苷(5 μmol/L)处理8h.使用激光共聚焦显微镜及神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)对小脑颗粒神经元细胞进行纯度鉴定.结果 细胞存活率达98.03%±1.048%;神经元纯度为99.71%±0.2%.结论 该方法获取的颗粒神经元存活率和纯度较高,是一种小鼠小脑颗粒神经元体外培养的可靠方法.

[目的]探究共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶失活诱导神经元凋亡的具体分子机制.[方法]体外成熟7 d的小脑颗粒神经元(CGNs)分别用含25 mmol/L KCl(25 K)培养基、5 mmol/L KCl(5 K)培养基和含ATM特异性抑制剂(Ku55933,10 μmol/L;Ku60019,15 μmol/L)的25 K培养基后进行免疫印迹检测ATM、Caspase3、Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平或培养8 h后进行Hoechst染色分析.在C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA,q-PCR和免疫印迹验证其干扰效率.体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染ATM特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h后进行Hoechst染色和凋亡分析.体外成熟7 d的CGNs用含ATM特异性抑制剂的25 K培养基培养8 h后进行全转录组测序、差异表达基因鉴定和通路富集分析.体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染GADD45α特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h,用含15 μmol/L Ku6的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理 8 h后进行Hoechst染色和凋亡分析.[结果]与25 K组相比,5 K处理组和ATM特异性抑制剂处理组的CGNs ATM蛋白表达降低、Cleaved Caspase-3蛋白表达增加、细胞核固缩率增加.C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA后有效降低ATM 和GADD45α 的mRNA和蛋白的表达.与对照相比,CGNs转染ATM特异性siRNA 后,细胞核固缩率升高.在Ku55933处理组中鉴定出835个基因表达上调,848个基因表达下调;在Ku60019处理组中鉴定出454个基因表达上调,314个基因表达下调;274个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同上调,179个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同下调,其中ATM下游靶标GADD45α表达上调;通路富集结果显示TNF信号通路、NF-κB信号通路和凋亡信号通路等被显著富集.与对照相比,抑制剂处理组和5K组GADD45α的mRNA和蛋白表达均升高.与对照相比,转染GADD45α特异性siRNA后用含15 μmol/L Ku60019的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理后的CGNs细胞核固缩率降低.[结论]ATM活性降低诱导GADD45α依赖的神经元凋亡.

目的 探究海洛因致小脑颗粒细胞凋亡中c-Jun氨基端激酶(c-Jun)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白质的表达情况,分析c-Jun和Bcl-2与海洛因影响小脑颗粒细胞凋亡的关系.方法 取8只出生7d的SD大鼠小脑颗粒细胞进行体外培养,随机分为实验组(以80 mg/L海洛因干预)、抑制剂组(以80 mg/L海洛因和10 μmol/L CEP1347干预)、正常组(正常培养的小脑颗粒细胞).采用Hoechst 33258荧光染色技术检测细胞凋亡率,采用免疫荧光、Western blot检测c-Jun和Bcl-2蛋白的表达情况.结果 实验组细胞凋亡率较抑制剂组及正常组高(P＜0.05);实验组与正常组比较,c-Jun蛋白含量明显升高(P＜0.05),Bcl-2蛋白含量下调(P＜0.05);抑制剂组中c-Jun蛋白含量较实验组明显下降(P＜0.05).结论 c-Jun和Bcl-2参与海洛因致小脑颗粒神经元细胞凋亡过程,并且可能是c-Jun氨基末端激酶信号通路中的重要候选促凋亡因子.

本研究通过体外分离培养及鉴定原代小鼠小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons,CGNs),为神经科学研究提供原代神经元细胞模型.取生后第7天的ICR乳鼠小脑,在解剖体视镜下剥离脑膜及血管,经刀片切碎、0.25％胰酶消化、移液器吹打、70μm尼龙滤网制备单细胞悬液,差速贴壁后接种于新鲜配置的培养基.倒置相差显微镜观察不同时间CGNs的形态变化.采用神经元的标记蛋白微管相关蛋白-2 (microtubule associated protein 2,MAP2),星形胶质细胞的标记蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),小胶质细胞的标记蛋白(type 3 complement receptor,CR3/CD11b)进行免疫荧光检测培养的原代CGNs纯度.原代培养CGNs接种20 min后即贴壁良好,培养24 h后细胞伸出突起,培养第7天神经元成熟,形成丰富的轴突,树突和胞间突触连接.经免疫荧光鉴定,CGNs纯度可达95％以上.成功体外分离培养出高纯度的原代CGNs,可应用于CGNs的体外研究.

[目的]研究抑制组蛋白去乙酰化酶成员HDAC4对SD大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的影响及机制.[方法]将原代培养6～9d的CGN分为存活对照组(用含K+浓度为25 mmol/L的培养基,即25 K组)、凋亡组(用含K+浓度为5 mmol/L的培养基,即5K组)和LMK-235处理组(5K合并LMK-235处理组),在5K条件下用不同浓度HDAC4抑制剂LMK-235处理细胞.在转染实验中,将CGN分为25 K+siNC组、5 K+siNC组、5 K+siH-DAC4-1组和5 K+siHDAC4-2组,共转染GFP标记目的细胞.用Western blot法检测p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun 的表达水平,用Hoeehst染色法观察并统计核固缩情况,用免疫荧光检测c-Jun磷酸化水平.[结果]Western blot结果显示,与5K组比较,LMK-235处理细胞后JNK、c-Jun磷酸化水平下降.核染色结果显示,与25 K组比较,5K组核固缩率明显增多(P＜0.05);与5K组比较,LMK-235处理细胞后核固缩率明显减少(P＜0.05).与5K+siNC组比较,小分子干扰HDAC4后,HDAC4的表达下调,c-Jun的磷酸化水平降低,CGNs核固缩率明显减少(P＜0.05).[结论]抑制HDAC4通过下调JNK/c-Jun活性使神经元核固缩率减少,从而抑制神经元凋亡.

目的 总结神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)的临床和脑电图特点.方法 回顾性分析北京大学第一医院儿科2000年2月至2015年8月确诊为NCL患儿的临床表型和脑电图检查结果.结果 30例患儿中,男18例,女12例;发病年龄9个月～7岁;首发症状为癫痫发作22例,智力运动发育落后或倒退7例,视力下降1例.临床表现包括进行性智力运动倒退29例,癫痫发作28例(其中17例有多种发作类型,肌阵挛发作23例,局灶性发作16例,不典型失神发作5例,强直阵挛发作3例,失张力发作1例,强直痉挛发作1例),视力下降19例,共济失调20例,锥体束征阳性13例.21例眼底检查,其中黄斑变性7例,视神经萎缩8例,视网膜色素变性2例,正常8例.30例头颅磁共振成像(MRI)检查均显示脑萎缩,其中大脑皮质及小脑弥散性萎缩14例,仅有小脑萎缩6例,脑萎缩伴侧脑室旁白质T2W高信号10例.脑电图(EEG)检查27例,背景均为弥散性慢波,睡眠期无顶尖波及睡眠纺锤波7例;局灶性痫样放电15例,广泛性痫样放电6例,兼广泛性和局灶性痫样放电6例,广泛性慢波阵发4例;闪光刺激诱发痫样放电3例;10例监测到临床发作,其中肌阵挛发作4例,不典型失神发作3例,局灶性发作3例,失张力发作1例,强直痉挛发作1例.外周血酶学检查13例,其中三肽基肽酶(TPP1)缺乏8例,棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1)缺乏1例.28例患儿进行了皮肤和/或肌肉电镜活检,皮肤和/或肌肉电镜检查见曲线体15例、嗜锇颗粒2例、指纹体2例、曲线体及直线体1例、指纹体及嗜锇颗粒1例.3例患儿行NCL相关基因检测,分别发现1例CLN6基因复合杂合突变及2例TPP1基因纯合突变.30例患儿依据发病年龄、酶学检查及皮肤和肌肉病理检查结果分为婴儿型5例、晚婴型20例及少年型5例.结论 儿童NCL的临床特点为多种类型的癫痫发作(肌阵挛发作最常见)、智力运动发育落后或倒退、视力下降、共济失调和锥体束征阳性;头颅MRI特点为脑萎缩,伴或不伴脑白质病变;脑电图背景为弥散性慢波,痫样放电可为局灶性和/或广泛性;特异性酶学或皮肤、肌肉病理检查或基因检测可明确诊断.

目的 观察褪黑素能否通过MAPK/ERK信号通路,发挥对阿尔茨海默病大鼠小脑的神经保护作用.方法 将32只♂SD大鼠随机分为4组:对照组、Aβ1-42侧脑室注射组(AD)、褪黑素腹腔注射组(MT)、Aβ1-42侧脑室注射结合褪黑素腹腔注射组(AD+MT).HE染色观察各组大鼠小脑皮层的病理学变化;免疫荧光染色观察各组颗粒细胞标记物Ne-uN、浦肯野细胞标记物Calbindle和p-ERK蛋白的表达情况;Western blot检测各组小脑组织中p-ERK蛋白的表达.结果 HE 染色结果显示,AD 组大鼠小脑皮层的神经元数量减少,细胞排列紊乱,细胞形态改变,褪黑素可明显减轻侧脑室注射Aβ1-42 对小脑的病理学损害;免疫荧光结果显示,与AD组相比,AD + MT 组颗粒细胞标记物NeuN 的蛋白表达增加,以Calbindin 标记的浦肯野细胞个数明显增多(P < 0. 01),p-ERK 蛋白表达减少(P < 0. 01);Western blot 结果显示,与AD 组相比,AD + MT 组小脑组织中p-ERK 蛋白表达水平降低.结论 褪黑素可能通过抑制MAPK/ ERK 信号通路的激活,发挥对小脑皮层神经原的保护作用.