目的:利用汉逊酵母系统重组表达人细小病毒B19(human parvovirus B19, B19V)主要衣壳蛋白VP2，并对VP2病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)进行理化性质研究及免疫效果评价。方法:重组表达B19V VP2蛋白，并使其自组装成VLP；通过高密度发酵和系列层析纯化步骤获得VP2-VLP；SDS-PAGE和凝胶过滤高效液相色谱检测蛋白质纯度，动态光散射和透射电镜观察颗粒形态，并检测VP2-VLP磷脂酶活性。采用ELISA和红细胞凝集抑制试验检测小鼠体内VP2-VLP特异性IgG抗体和中和抗体水平。结果:本研究制备的重组VP2-VLP纯度大于95%，颗粒均一且形态良好，大小近似天然病毒颗粒；VLP可与特异性单克隆抗体结合，磷脂酶A2活性为阴性；吸附佐剂后的VP2-VLP能够诱导小鼠产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体。结论:汉逊酵母表达系统制备的B19V VP2-VLP可作为候选靶抗原用于B19V预防性疫苗的开发。

目的 旨在建立基于实时荧光多酶恒温扩增(exo-MIRA)技术的小鼠细小病毒(MVM)核酸检测新方法.方法 收集2021年1月至2022年1月南京大学医学院附属金陵医院实验动物室共75份小鼠肠道内容物标本.针对MVM VP2基因的保守区域设计4对引物,琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物以筛选最优引物对,并设计特异性荧光探针,构建exo-MIRA 检测法.通过检测梯度稀释模拟样本,进行检出限评价.检测其他小鼠病毒,包括仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠鼠痘病毒(Ect)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒(Reo),分析exo-MIRA法的交叉反应性.采用qPCR法和exo-MIRA法同时检测收集的75份标本,统计分析两种方法的一致性.以qPCR法为参比方法,评估该法的敏感度和特异度,进行诊断效能评价.结果 采用exo-MIRA技术建立MVM核酸检测方法,该方法检测MVM的检出限为10 copies/μL,且与其他五种小鼠病毒无交叉反应,可特异性检出MVM.75份标本检出结果显示,exo-MIRA法和qPCR法高度一致,Kappa值为0.921(P＜0.05),exo-MIRA法的敏感度为100.0％,特异度为96.7％.结论 建立了一种基于实时荧光MIRA恒温扩增技术的MVM核酸检测方法,具有简单快速、实验要求低、敏感特异等优点.该方法可应用于现场复杂环境的即时检测,在实验动物质量检测应用上有一定前景.

目的 建立多瘤病毒荧光定量PCR检测方法,并对裸鼹鼠中多瘤病毒感染情况进行调查.方法比较NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank:NC 001515)的核酸序列,选择保守区域设计引物和探针,建立多瘤病毒的荧光定量PCR方法,对方法的敏感性和特异性进行验证.人工感染9只1日龄KM乳鼠,21 d后采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、盲肠内容物和血液等组织脏器,用建立的荧光PCR方法进行检测,验证方法在应用中的有效性,最后用该方法检测62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本.结果建立的检测方法特异性好,在以多瘤病毒为模板时出现明显的荧光信号,以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠细小病毒H-1株为模板时无荧光信号出现;方法的最低检出限为100 copies/μL;人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物中均检测到多瘤病毒核酸,其中肺组织中含量最高,脑、胸腺和血液中未检出;62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本经检测多瘤病毒为阴性.结论建立的多瘤病毒荧光定量PCR方法可有效检测动物组织中的多瘤病毒,对裸鼹鼠自然感染多瘤病毒的调查为实验用裸鼹鼠微生物标准的制定提供了参考.

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用.方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV.考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测.结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强.应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染.阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96％.结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒.

目的 通过对2011～2015年四川地区实验动物微生物、寄生虫抽检结果的回顾和总结,为提高四川实验动物质量提供参考.方法 按照现行国家实验动物检测的相关标准,对四川省内具备资质的实验动物生产单位进行抽样检测,并出具报告,对这几年四川省不同级别大小鼠、豚鼠、兔、犬、猴、小型猪等实验动物的质量进行分析.结果 4年中,每年抽检频率和抽检动物数基本稳定,SPF级大鼠2012年两家单位检出蠕虫,阳性率为22.5％;在不同单位连续四年检出金黄色葡萄球菌,阳性率分别为5.0％,5.0％,40.0％,11.4％;2015年有三家单位大鼠细小病毒RV株、H-1株病毒抗体成阳性,阳性率为34.3％,28.6％.SPF级小鼠2012、2013年分别在不同单位检出体外寄生虫,阳性率为7.1％,12.9％;蠕虫阳性率在2012年为10.0％,2013年为1.4％,2015年为7.5％;2011年一家单位检出肺炎克雷伯杆菌,阳性率为1.4％.豚鼠(包括清洁级)在这几年抽检中未检出阳性.兔在2013年一家单位检出弓形虫,阳性率为10％.犬在2012年分别从两家单位检出皮肤真原菌和弓形虫,阳性率为5.0％和2.5％.猴2011年有两家单位检出皮肤真原菌,阳性率为9.5％,2011、2012年同一家单位连续两年志贺菌阳性,阳性率为2.4％,2.5％,猕猴疱疹病毒I型2012年一家单位检出阳性,阳性率为2.5％.2015年第一次检测实验用小型猪,只做了布氏杆菌和弓形虫,结果均为阴性.结论 实验动物质量监督抽检是确保实验动物质量的重要手段,对提高四川省实验动物质量,减小与发达地区的差距,促进四川实验动物行业发展至关重要.

目的 验证重组人凝血因子Ⅷ(recombinant human coagulationⅧ,rhFⅧ)病毒灭活/去除工艺.方法 采用S/D法作为rhFⅧ病毒灭活工艺,纳米过滤(20 nm孔径)作为rhFⅧ病毒去除工艺,分析病毒灭活/去除两步工艺对rhFⅧ活性的影响;分别以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、小鼠白血病病毒(xenotropic murine leukemia virus,X-MuLV)及小鼠细小病毒(murine minute virus,MMV)作为指示病毒,对上述工艺进行病毒灭活/去除效果验证.结果 S/D灭活工艺中,3批制品的活性收率分别为96.2％、100.4％和103.2％;(24±2)℃处理180 min后,指示病毒PRV、VSV和X-MuLV滴度降低量(Log10)虽然均＜4,但盲传3代,仍未检出病毒.纳米过滤工艺中,3批制品蛋白回收率均大于98％,活性回收率均大于90％,纳米过滤120 min,MMV滴度降低量(Log10)＞4.结论 建立的rhFⅧ病毒灭活/去除工艺,可有效灭活/去除病毒,保证制品的质量和安全.

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测.方法 参考Genebank 中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查.结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90.6 copy/μL.应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性.结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法.

目的 建立小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus,MHV)血清抗体ELISA检测方法,用于本地区MHV的日常监测,以便对SPF小鼠感染状况及时作出判断.方法 选取3种MHV毒株MHV1、MHV-JHM和MHV-A59,通过L929细胞扩增培养获得纯化浓缩抗原并筛选适合包被抗原类型;免疫BALB/C小鼠,获得高效价免疫阳性血清;优化ELISA反应体系建立规范化的ELISA试剂盒并用于临床小鼠血清样品的检测.结果 筛选出适合本地区的MHV包被抗原类型为MHV1,建立了病毒扩增及浓缩纯化方法,制备的MHV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为标准化质控血清.包被抗原、待检血清和酶结合物最佳工作浓度分别为4.0 μg/mL(10-7.73/0.1 mL TCID50)、1∶40和1∶4 000稀释;批次内和批次间平均变异系数分别为5.13％和5.57％;检测灵敏度为1∶4 000稀释;与小鼠仙台病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒Ⅲ型(Re03)、小鼠细小病毒(MVM)和鼠痘病毒(Ect)阳性血清均无交叉反应.稳定性试验相对偏差小于10％.对165份血清样品进行检测,阳性血清相符率97.37％ (37/38),阴性血清相符率92.19％ (118/127).结论 本研究建立的ELISA方法检测小鼠血清MHV抗体具有较高的特异性、敏感性和结果可重复性,可以用于本地区MHV日常病原学监测,以便对小鼠感染状况作出准确判断.

目的 通过实验小鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)抗体检测能力验证实施计划,了解我国实验动物检测机构的检验能力,促进实验动物质量检测水平的提高.方法 按照CNAS批准的能力验证方案,血清经过标定后,经过稳定性和均匀性等检验合格,作为能力验证样本.对血清样本采用随机编号形式发放给能力验证参加单位,并附作业指导书.本次能力验证为定性检测,检测方法采用ELISA方法.要求参加单位在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,满意结果为样品的检测结果与预检结果一致,不满意结果为样品检测结果与预检结果不一致或参加单位未反馈结果.结果 样本血清均匀性试验和稳定性试验结果显示,样本均符合能力验证样本均匀性和稳定性要求.本次能力验证共有19个省市的33个实验动物检测机构报名参加.33个检测机构均提交了满意结果,满意度为100％.结论 实施此次能力验证计划能够反映我国实验动物检测实验室的检测能力和水平,我国实验动物质量检测机构对实验小鼠细小病毒(MMV)抗体检测的能力较高.