重组酶聚合酶扩增（RPA）技术是一种新型核酸恒温扩增检测技术。该技术可以在37~42 ℃条件下实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测。本文从RPA技术的基础理论和实验要点出发概述了开展该项研究需要注意的要点，综述了RPA技术在医学检验领域的应用现状和相关问题，并展望了其未来发展的广泛前景。

重组酶聚合酶扩增技术作为一种新型的核酸恒温扩增检测技术，近年来已经展现出其巨大的应用潜力和发展前景。高敏感度、高特异度、对仪器依赖程度低以及可整合多种检测模式等独特的优势，使其在多个领域，特别是基层和现场即时检测中具有广泛的应用价值。本文对重组酶聚合酶扩增技术的发展历程、检测原理、研究动态及应用进展进行综述，并对其未来发展进行展望，以期为基于重组酶聚合酶扩增技术的病原体快速检测方法的研发和临床应用提供有益参考。

幽门螺杆菌( Helicobacter pylori, Hp)与很多胃肠道疾病甚至是胃肠外疾病密切相关。目前幽门螺杆菌的常规检测技术包括快速尿素酶试验、病理组织学检查、血清抗体检测、粪便抗原检测、尿素呼气试验等，随着在临床应用中发现这些技术均存在不同程度的缺陷，因此需要探索新技术来弥补。恒温核酸扩增技术中的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术近年发展迅速，具有快速、特异、敏感、简便等特点，使该技术在核酸检测领域得到了广泛的应用。文章就Hp感染诊断及LAMP技术在诊断、毒力分型领域内的研究进展进行综述，期望为后续研究者们提供更多信息。

目的 开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析.方法 采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略;测试200例孕妇人群样本MTHFR基因C677T多态性,并与常规PCR产物测序结果进行一致率比较.结果 基于CRISPR/Cas12a检测人MTHFR基因C677T多态性的检测方法结果准确、特异性好,与PCR产物测序结果具有高度一致性.结论 建立的基于CRISPR/Cas12a检测技术的人MTHFR C677T基因分型方法简单、快捷、精准,为叶酸代谢位点MTHFR C677T基因型检测提供了新的途径,具有潜在的临床应用前景.

目的 基于荧光多酶恒温快速扩增(MIRA)技术,建立一种快速准确检测食品中产气荚膜梭菌的方法.方法 利用产气荚膜梭菌共有α毒素编码基因plc保守序列设计引物探针,并建立和优化荧光MIRA方法;提取17种非目标菌基因组DNA进行方法特异性验证;梯度稀释目标菌基因组DNA和菌液用于方法灵敏度评价;选取4种食品进行基质干扰试验,评估方法的稳定性;检测实际样品并与国家标准方法进行比较,以验证该方法的实用性.结果 该方法特异性强,检测多种非目标致病菌均呈阴性反应;灵敏度高,以基因组DNA为模板和菌液为模板时最低检测限分别为1.05×101fg/μL和7.5×10℃FU/mL;该方法不受基质影响,抗干扰能力强;耗时短,约20 min即可完成检测.结论 本研究中的荧光MIRA方法快速准确、灵敏度高、特异性强,可用于食品中产气荚膜梭菌的快速检测.

目的 建立一种霍乱弧菌O1群与O139群产毒株快速准确的检测方法.方法 基于多酶恒温快速扩增技术,根据霍乱弧菌溶血素编码基因、霍乱毒素编码基因、O1群与O139群O抗原编码基因设计引物与探针,初步建立检测方法.以不同血清型霍乱弧菌及其它细菌DNA为模板,验证检测方法的特异性与灵敏度.结果 配制反应体系时,按试剂盒说明书推荐加入量0.6 μL加入探针时可成功扩增溶血素编码基因、霍乱毒素编码基因及O1群与O139群O抗原编码基因4个目的基因,针对上述4个基因分别优化探针加入量为1.0μL、1.0μL、1.0 μL、0.8 μL时扩增效率更高.对优化探针加入量的检测方法进行方法特异性验证时,各引物探针组合不与非目标菌DNA产生交叉反应.进行检测方法的灵敏度分析时,不同目的基因的基因组检测灵敏度为70 fg或290 fg.上述实验结果证明检测方法的灵敏度及特异性满足设计要求.结论 建立了一种霍乱弧菌O1群与O139群产毒株检测的新方法,该方法特异性强、灵敏度高、检测时间短,可适用于霍乱弧菌的常规检测及快检,对霍乱的预防具有一定的积极作用.

目的 建立逆转录多酶恒温扩增试纸条法(RT-MIRA-LFD),用于快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸.方法 依据SARS-CoV-2开放阅读框(ORF1ab)基因和核壳蛋白(N)基因序列设计RT-MIRA反应引物;筛选RT-MIRA-LF反应的最佳引物和探针;评价RT-MIRA-LF检测 SARS-CoV-2的敏感度、特异度、阳性符合率和阴性预测值等诊断效能.结果 建立的RT-MIRA-LFD方法检测SARS-CoV-2核酸特异性良好,与其他类型的病毒均无交叉反应.该方法检测ORF1ab基因和N基因的最低检出限均为100拷贝/μL,该方法的敏感度为90.00%,特异度为100.00%,阳性预测值均为100.00%,阴性预测值为95.24%.结论 基于RT-MIRA-LFD技术建立的检测SARS-CoV-2核酸新方法具有良好的临床诊断效能.

为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rha-bdovirus,MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法.实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证.结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmo1/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果.并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏性,此外检测结果可直接通过紫外灯照射直接观察.研究基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法,可在室温下且不需要昂贵的仪器进行MSRV病毒检测,检测结果可以肉眼直接观察,能在多种场合下使用,研究结果为检测MSRV提供了有效方法.

目的 旨在建立基于实时荧光多酶恒温扩增(exo-MIRA)技术的小鼠细小病毒(MVM)核酸检测新方法.方法 收集2021年1月至2022年1月南京大学医学院附属金陵医院实验动物室共75份小鼠肠道内容物标本.针对MVM VP2基因的保守区域设计4对引物,琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物以筛选最优引物对,并设计特异性荧光探针,构建exo-MIRA 检测法.通过检测梯度稀释模拟样本,进行检出限评价.检测其他小鼠病毒,包括仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠鼠痘病毒(Ect)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒(Reo),分析exo-MIRA法的交叉反应性.采用qPCR法和exo-MIRA法同时检测收集的75份标本,统计分析两种方法的一致性.以qPCR法为参比方法,评估该法的敏感度和特异度,进行诊断效能评价.结果 采用exo-MIRA技术建立MVM核酸检测方法,该方法检测MVM的检出限为10 copies/μL,且与其他五种小鼠病毒无交叉反应,可特异性检出MVM.75份标本检出结果显示,exo-MIRA法和qPCR法高度一致,Kappa值为0.921(P＜0.05),exo-MIRA法的敏感度为100.0％,特异度为96.7％.结论 建立了一种基于实时荧光MIRA恒温扩增技术的MVM核酸检测方法,具有简单快速、实验要求低、敏感特异等优点.该方法可应用于现场复杂环境的即时检测,在实验动物质量检测应用上有一定前景.

以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)为基础的体外核酸扩增技术已成功应用于科学研究各方面.近年来等温扩增技术(Isothermal amplification technology)凭借恒温、高效、耗时短、不过分依赖设备仪器等优点越来越多地被应用于分子诊断及疾病检测中.本文对现有的部分等温扩增技术原理、特点以及在寄生虫病病原体及其他病原体检测方面的应用进行综述,并展望其应用前景.