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高效液相尺寸排阻色谱-多角度激光散射定量检测灭活禽流感病毒抗原中完整病毒颗粒
编辑人员丨2024/3/30
本研究旨在建立一种灭活禽流感病毒原料液中完整病毒颗粒准确定量的方法.针对直接采用高效液相尺寸排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)检测灭活禽流感病毒原液存在杂质干扰的问题,首先以H5N8型抗原为对象,分别考察了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀和离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC)进行预处理.在优化条件下,经 DEAE FF阴离子交换层析纯化预处理,杂蛋白去除率为 86.87%,病毒血凝回收率为 100%.HPSEC分析预处理后的样品,8.5-10.0 min处色谱峰样品电泳检测显示主要为H5N8 病毒蛋白,动态光散射分析平均粒径为 127.7 nm,推测为完整病毒特征峰;在IEC预处理后的样品中加入抗体进行HPSEC检测,8.5-10.0 min处特征峰消失,显示IEC预处理有效去除了杂质干扰.通过将HPSEC与多角度激光散射技术(multi-angle laser scattering technique,MALLS)联用,可以准确获得样品中完整病毒颗粒的数量,且病毒颗粒数与色谱峰面积具有良好线性关系(R2=0.997).建立的IEC预处理-HPSEC-MALLS检测方法应用于其他亚型(H7N9)、批次和浓度的病毒原液中完整病毒颗粒数的准确检测,均具有良好适用性,且重复性好,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)<5%,n=3.
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编辑人员丨2024/3/30
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重组人生长激素-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱检测方法的优化及验证
编辑人员丨2023/11/18
目的 优化重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法,并对优化的方法进行验证.方法 利用SEC-HPLC法对rhGH-Fc免疫融合蛋白中多聚体含量进行检测,优化检测条件(盐浓度、流动相pH、流速、柱温及色谱柱型号),观察目的蛋白与聚合体分离的效果.对方法的系统适应性、专属性、线性与范围、精密性、准确性及定量限进行验证.结果 优化后的方法为采用TSK-gelG2000SWxl色谱柱(5 μm,7.8mm× 300 mm)进行测定,流动相50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.80),检测波长280 nm,进样量100μL,流速0.6 mL/min,柱温45℃.rhGH-Fc免疫融合蛋白与聚合物分离度、理论塔板数、拖尾因子均能满足要求;rhGH-Fc免疫融合蛋白样品与对照品出峰时间一致,GH国家标准品与对照品出峰时间不同,蛋白缓冲液不出峰;rhGH-Fc免疫融合蛋白浓度在0.307~1.842 mg/mL范围内,其峰面积与上样量呈良好的线性关系(R2=0.9994);重复性验证峰面积和纯度的RSD分别为0.7%和0.1%;中间精密性验证的RSD为0.8%;准确性验证的平均回收率为99.1%,RSD为1.9%;定量限为6μg/mL.结论 采用优化后的SEC-HPLC法检测rhGH-Fc免疫融合蛋白多聚体含量,准确性有所提高,柱效与分离度符合《中国药典》四部(2020版)的相关规定,可用于对样品中高分子含量的检测.
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编辑人员丨2023/11/18
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GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白的表达与鉴定
编辑人员丨2023/8/6
将合成的人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)突变体基因与IgG4抗体的Fc部分进行融合获得GLP-1-IgG4-Fc片段,获得的基因片段与pXC17.4载体进行连接,用电转化方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过ClonePix 2筛选出高表达细胞株,产量达1.5g/L.收集培养上清并经Protein A和Source 30Q纯化,得到的GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白,SDS-PAGE纯度高于95%,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度和毛细管区域凝胶电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)纯度均不低于80%,尺寸排阻层析(size-exclusionchromatography,SEC)纯度高于99%.经质谱和肽图谱测定,分子量与理论值一致,肽图谱序列与对照品高度一致.生物学活性分析表明,GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞分泌环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的活性,并且该活性与对照品高度相似.
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编辑人员丨2023/8/6
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雄性土鳖虫中不同分子量多肽活性研究
编辑人员丨2023/8/6
目的:对雄性土鳖虫不同分子量物质进行活性测定,得到最强活性片段.方法:采用不同截留孔径的超滤、纳滤;DA201-c树脂、葡聚糖G25对样品进行分子量分离,得到不同分子量组分,并采用体外抗凝实验、溶栓实验、平板实验等测定其活性.结果:采用超滤、纳滤得到小于1000 Da、1000~3000 Da、大于3000 Da组分,并通过实验测定得到1000~3000 Da的物质活性最强,再通过DA201-C树脂对活性组分进行极性分离,得到三个洗脱组分:25%乙醇洗脱组分、50%乙醇洗脱组分、75%乙醇洗脱组分.并通过抗凝、溶栓试验得到50%乙醇洗脱组分活性最强.再将50%乙醇洗脱组分经过G25进行分离,得到三个峰位,分别记为FIV1、FIV2、FIV3.经抗凝、溶栓实验测得FIV2活性强.在经过高效液相得出FIV2组分的分子量集中于1000~ 1500 Da.结论:通过超滤、树脂、尺寸排阻色谱分离得到的活性组分,可以进一步进行分离,为以后的肽段测序奠定基础.
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编辑人员丨2023/8/6
