1例41岁女性2型糖尿病患者长期应用二甲双胍、格列美脲、西格列汀和阿卡波糖，因血糖升高调整降糖方案为口服二甲双胍和阿卡波糖，并予度拉糖肽1.5 mg皮下注射、1次/周。每次应用度拉糖肽后患者均出现严重厌食，但可耐受，未干预。第1次注射度拉糖肽3 d后加用恩格列净5 mg、1次/d，次日调整为10 mg、1次/d。第4次注射度拉糖肽次日，患者出现头晕、恶心、呕吐、全身乏力等，实验室检查示血糖20.0 mmol/L、动脉血pH 7.22、尿酮体（+++）、尿糖（++++）。诊断为糖尿病酮症酸中毒（DKA）。考虑应用度拉糖肽后严重厌食导致碳水化合物摄入严重不足，与恩格列净并用导致DKA。停用2药，并予对症治疗5 d，实验室检查：午餐后血糖10.1 mmol/L，尿酮体（+），尿葡萄糖阴性，尿pH 5.5。加用恩格列净（5 mg、1次/d），4 d后血二氧化碳结合力23.2 mmol/L、尿酮体（+++）、尿葡萄糖（++++），尿pH 5.0。患者坚持出院，出院后应用重组甘精胰岛素、阿卡波糖、恩格列净降糖。1个月后随访，患者未再出现DKA相关症状。

目的 探讨西格列汀联合精蛋白锌重组赖脯胰岛素混合注射液(优泌乐)50对老年肥胖2型糖尿病患者血清鸢尾素(irisin)、脂联素(APN)水平的影响.方法 68例肥胖2型糖尿病患者以随机数字表法分为对照组(34例,常规运动、饮食控制+优泌乐50治疗)和观察组(34例,常规运动、饮食控制+优泌乐50+西格列汀治疗),共治疗3个疗程.比较两组治疗前和治疗3个疗程时血糖水平[糖化血红蛋白(HbA1c)、餐后2 h血糖(2 h PPG)、空腹血糖(FBG)]、胰岛素相关指标[胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰高血糖素样肽(GLP)-1、空腹胰岛素(FIns)]、体质量指数、血清irisin、APN水平.结果 治疗3个疗程时,对照组HbA1c、2 h PPG、FBG水平显著高于观察组(P＜0.05);治疗3个疗程时,对照组GLP-1、FIns水平显著低于观察组,HOMA-IR水平显著高于观察组(P＜0.05);治疗3个疗程时,对照组体质量指数显著高于观察组(P＜0.05);治疗3个疗程时,对照组血清APN、irisin水平显著低于观察组(P＜0.05);治疗期间,两组不良反应总发生率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 老年肥胖2型糖尿病患者采用西格列汀联合优泌乐50治疗可降低血糖水平、体质量指数,改善胰岛素相关指标,提高血清irisin、APN水平,且不会增加不良反应.

为研发一种用于治疗 2 型糖尿病的新型生物药物,本研究运用实验室前期构建的10rolglp-1基因和CRISPR/Cas9 基因组编辑技术创建了重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株.构建了向导 RNA(guide RNA,gRNA)表达载体 pyES2-gRNA、供体载体 pNK1-L-PGK-10rolGLP-1-R和Cas9 表达载体pGADT7-Cas9,将这些表达载体共转化酿酒酵母INVSc1 菌株,通过同源重组途径敲入 PGK-10rolGLP-1 表达单元,最终得到具有降血糖功能、高表达 10rolGLP-1的酿酒酵母.通过SDS-PAGE和蛋白质印迹,筛选出 2 种稳定表达 10rolGLP-1 的酿酒酵母重组菌株.降血糖实验结果表明,重组降血糖酿酒酵母对糖尿病小鼠模型具有显著的降血糖作用,其血糖下降平缓,可避免引起低血糖风险.体重变化和多尿等其他症状也明显改善,表明本研究构建的口服降血糖酿酒酵母有望成为一种简单有效、经济实用的糖尿病生物药物.

胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)具有抑制胰高血糖素升高、抑制胃酸分泌、减缓胃肠道蠕动等作用,但分子的血浆半衰期仅有几分钟到几小时,为达到治疗效果需频繁、高剂量给药,增加了不良反应发生的风险.因此,长效化是GLP-1 类药物的重要研究方向.在现有的长效化策略中,脂肪酸链修饰具有修饰位点明确、修饰产物异质性低、生物学活性损失小和毒副作用小等优点,在长效GLP-1 药物中广泛应用.本文将结合在实际审评中积累的对脂肪酸修饰的GLP-1 类药物的审评经验,从生产用原材料、生产工艺、质量控制、稳定性研究等方面,提出对脂肪酸链修饰的重组GLP-1 类药物的药学审评考虑,以期为脂肪酸链修饰的GLP-1 及其他脂肪酸链修饰类多肽药物的研究和审评提供参考.

将合成的人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)突变体基因与IgG4抗体的Fc部分进行融合获得GLP-1-IgG4-Fc片段,获得的基因片段与pXC17.4载体进行连接,用电转化方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过ClonePix 2筛选出高表达细胞株,产量达1.5g/L.收集培养上清并经Protein A和Source 30Q纯化,得到的GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白,SDS-PAGE纯度高于95％,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度和毛细管区域凝胶电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)纯度均不低于80％,尺寸排阻层析(size-exclusionchromatography,SEC)纯度高于99％.经质谱和肽图谱测定,分子量与理论值一致,肽图谱序列与对照品高度一致.生物学活性分析表明,GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞分泌环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的活性,并且该活性与对照品高度相似.

目的:对重组胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白(rGLP-1-Fc)的制品相关蛋白进行定性及定量分析.方法:利用液质联用法,对rGLP-1-Fc原液中制品相关蛋白的修饰类型进行鉴定;通过胰蛋白酶酶切液质肽图的方法,对修饰位点进行鉴定;采用反相超高效液相色谱法,测定3批原液中制品相关蛋白的比例.结果:该蛋白原液中主要存在3种制品相关蛋白;液质联用检测结果显示:1种为氧化及糖化的修饰产物,另外2种为一条二硫键解链导致的变异体;液质肽图分析发现氧化及糖化发生在第28位赖氨酸残基;对3批原液进行了检测,3种制品相关蛋白的平均含量分别为(2.37±0.04)％、(9.07±0.20)％和(4.03±0.07)％.结论:利用液质联用技术对rGLP-1-Fc原液中的制品相关蛋白进行了初步的定性、定量分析,测定结果可为同类产品的制品相关蛋白分析提供技术支持.

目的 探讨2型糖尿病(T2DM)合并超重/肥胖患者使用胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RAs)治疗对不同部位的脂肪分布及肌肉含量的影响.方法 回顾性调查2014年12月～2015年9月于南方医科大学南方医院内分泌代谢科诊断为T2DM且体质量指数(BMI)≥24 kg/m2的76例患者,按BMI分为超重组(BMI 24～27.9 kg/m2)14例、肥胖组(BMI 28～31.9 kg/m2)35例及严重肥胖组(BMI≥32 kg/m2)27例,予GLP-1RA治疗3.0～29.0周(平均8.9周),比较各组治疗前后体质量、BMI、腰臀比、内脏脂肪指数、身体脂肪率及四肢肌肉率的变化.结果 治疗前,各组的性别、年龄、身高、糖脂代谢指标、其他降糖药使用等均无显著统计学差异.治疗后,各组体质量均明显降低,但仅超重组和肥胖组差异有统计学意义(P<0.05);各组BMI和内脏脂肪指数均较前明显降低(P<0.05);超重组腰臀比较前明显降低(P<0.05);肥胖组与严重肥胖组的身体脂肪率及各部位脂肪率均明显下降且肌肉率明显增加(P<0.05).与超重组相比,肥胖组身体脂肪率和内脏脂肪指数下降更明显(P<0.05),肥胖组与严重肥胖组的肢体皮下脂肪率降低及肌肉率升高更明显(P<0.05).结论 GLP-1RAs可显著改善T2DM合并超重/肥胖患者各部位的脂肪沉积,且BMI指数越高的患者体质构成的改善越明显.

目的:构建及鉴定携带His标签的重组胰高血糖素样肽-1(modified glucagon-like peptide-1,mGLP-1)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌WB800N中的分泌表达.方法:经化学合成得到含有His标签及BamHⅠ/XbaⅠ酶切位点的mGLP-1基因片段,将其酶切后插入含信号肽amyQ序列的大肠埃希菌枯草芽孢杆菌双穿梭载体pHT43中,得到重组载体pHT43-mGLP-1;通过电转化方法将质粒pHT43-mGLP-1转化到枯草芽孢杆菌WB800N中,构建含有目的基因的重组菌株WB800N/pHT43-mGLP-1,利用聚合酶链式反应(PCR)、碱基测序、甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)及蛋白质印迹法鉴定重组的枯草芽孢杆菌.结果:菌落PCR和测序结果表明,阳性克隆质粒pHT43-mGLP-1成功转化进枯草芽孢杆菌WB800N;Tricine-SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测表明,重组菌株WB800N/mGLP-1培养上清液中有mGLP-1蛋白表达,且1 mmol/L IPTG诱导下蛋白表达量明显增加.结论:成功构建了携带mGLP-1基因的表达载体并实现了其蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为后续动物实验和制备微生态活菌制剂奠定了基础.

目的:采用血糖仪进行德谷胰岛素和门冬胰岛素的生物学活性以及利拉鲁肽、索马鲁肽的葡萄糖耐量研究.方法:生物学活性研究:小鼠分4组,分别皮下注射标准品及高、低剂量样品40 min后,用血糖仪快速测定小鼠血糖值,第1次给药后按双交叉设计,对小鼠进行第2次给药;按照生物检定统计法中量反应平行线测定双交叉设计法计算效价及可信限率.葡萄糖耐量研究:小鼠分3组,分别皮下注射利拉鲁肽(剂量320 μg·kg-1)、索马鲁肽(剂量320 μg· kg-1)和空白对照,给药后24、48、72、96 h腹腔注射40％葡萄糖0.2 mL,免疫前及免疫后15、30、60 min尾静脉采血并用血糖仪测定血糖值,评价给药后小鼠葡萄糖耐量情况.结果:生物学活性研究:德谷胰岛素(CA501)制剂用3批原研德谷胰岛素为标准品,测定效价分别为97.3、108.1、91.6 U· mL-1.德谷胰岛素(CA501)原料药和门冬胰岛素原料药效价结果分别为34.1、22.3U·mg-1.葡萄糖耐量研究:与空白对照相比,利拉鲁肽、索马鲁肽在给药24、48、72、96 h后注射葡萄糖15min及30 min时仍有明显降糖作用.结论:采用血糖仪检测血糖值具有操作简便,测量快速准确,用血量少,重复性好等优点,适用于胰岛素类药物的研究.

目的 观察重组人胰高血糖素样肽-1(7-36)[rhGLP-1(7-36)]联合他克莫司作用于人肝细胞系HL7702细胞系后对Akt表达的影响.方法 选用处于对数生长期的人肝细胞系HL7702,分为4组:对照组、G组、F组及GF组.对照组用等量的培养基处理90 min;G组用含100 nmol/L的rhGLP-1(7-36)培养基处理90 min;F组用含5 mg/L的他克莫司处理90 min;GF组用含100 nmol/L的rhGLP-1(7-36)及5 mg/L的他克莫司处理90 min.Western blotting检测各组Akt蛋白表达水平.结果 各组p-AktThr308相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05);G组、F组及GF组p-AktThr308相对表达水平与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),G组、F组及GF组均升高;各组p-AktSer473相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05);G组、F组及GF组p-AktSer473相对表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 rGLP-1(7-36)联合他克莫司能使Akt蛋白活化,提示GLP-1可能不依赖Akt蛋白改善他克莫司引起的肝脏脂质代谢紊乱.