目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的:评价补肾填精化瘀汤结合西医常规疗法治疗T2DM合并骨质疏松症的临床疗效。方法:选择2018年1－12月上海市嘉定区马陆镇社区卫生服务中心符合入选标准的T2DM合并骨质疏松症患者83例，按随机数字表法分为对照组41例和研究组42例。对照组采用西医常规疗法治疗，研究组在对照组基础上加服补肾填精化瘀汤。2组均连续治疗3个月。采用Accu-Chek Performa罗氏血糖仪检测空腹血糖、2 hPG，采用离子交换层析法检测HbAlc，采用ELISA法检测IL-6、NO，采用双能X线骨密度检测仪检测股骨颈、L 2～4及Wards三角区的骨密度，评价临床疗效。 结果:研究组总有效率为90.5%(38/42)、对照组为70.7%(29/41)，2组比较差异有统计学意义( χ2＝5.198， P＝0.023)。治疗后，研究组空腹血糖、2 hPG、HbAlc水平均低于对照组( t值分别为6.822、6.133、5.768， P值均<0.001)；股骨颈[(0.92±0.10)g/cm 2比(0.78±0.09)g/cm 2， t＝6.700]、L 2～4[(0.98±0.12)g/cm 2比(0.87±0.10)g/cm 2， t＝4.531]及Wards三角区[(0.69±0.08)g/cm 2比(0.61±0.06)g/cm 2， t＝5.144]骨密度水平均高于对照组( P<0.01)；血清IL-6、NO水平低于对照组( t值分别为23.244、13.541， P值均<0.001)。 结论:补肾填精化瘀汤结合西医常规疗法可明显控制T2DM合并骨质疏松症患者的血糖水平，改善骨密度，降低血清IL-6、NO水平，提高临床疗效。

目的:表达纯化猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原蛋白并分析三种蛋白在痘苗病毒免疫血清检测中的应用。方法:将猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原按照人源密码子优化合成后插入pVRC载体，转染HEK293T细胞后收获上清，通过Western blot方法验证蛋白表达，通过镍柱和离子交换层析柱纯化蛋白，并采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。分别以纯化A29L、B6R与M1R作为包被抗原，通过ELISA检测痘苗病毒免疫后的小鼠、恒河猴与人血清中IgG抗体滴度，并分析它们与血清中抗痘苗病毒、抗猴痘病毒中和抗体滴度的相关性。结果:猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白在细胞上清中均可大量分泌表达。经镍柱及离子交换层析柱进行蛋白纯化后，纯度均可达90%以上。痘苗病毒免疫的动物与人血清中均可检出针对三种蛋白特异的IgG抗体，三个抗原检测的IgG滴度显著相关，痘苗免疫血清中A29L、B6R、M1R特异的IgG与抗痘苗病毒中和抗体水平也显著相关，但与抗猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。结论:在痘苗病毒免疫血清中可检测到与猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白交叉反应的IgG抗体，且IgG滴度与抗痘苗病毒中和抗体水平显著相关，但与猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。该研究可为正痘（包括猴痘）病毒免疫学检测方法的应用及疫苗研发提供参考。

目的:建立高效的人肠三叶因子（ITF）重组表达及纯化策略，观察重组人ITF（rhITF）对烧伤小鼠肠黏膜损伤与修复的作用并探讨其机制。方法:采用实验研究方法。采用新型酵母表达载体pGAPZαA和酵母菌X33重组表达ITF，并通过金属螯合亲和层析与阴、阳离子交换层析法纯化蛋白，行非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及蛋白质印迹法鉴定rhITF。rhITF与胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液按体积比1∶1混合，分别作用0.5、1.0、1.5、2.0 h和1.0、2.0、4.0 h后行非还原SDS-PAGE，分析rhITF的稳定性。按随机数字表法将105只6~8周龄BALB/c雄性小鼠分为假伤组（30只）、单纯烧伤组（45只）、烧伤+rhITF组（30只）。将单纯烧伤组和烧伤+rhITF组小鼠背部造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤，假伤组小鼠模拟致假伤，烧伤+rhITF组小鼠伤后灌胃1 mg/kg rhITF，其余2组小鼠伤后给予等量生理盐水。伤后24 h，取15只单纯烧伤组小鼠，制备烧伤血清，用于细胞实验。伤后3、5、7 d，每组各取10只小鼠处死后取小肠组织，苏木精-伊红染色观察肠黏膜病理变化，分光光度法和酶联免疫吸附测定法测定肠组织二胺氧化酶（DAO）及乳酸脱氢酶（LDH）活性。取3批人结直肠腺癌HT-29细胞，分为阴性对照组、25 μg/mL rhITF组、50 μg/mL rhITF组（样本数为3），正常对照组、烧伤血清组、烧伤血清+rhITF组（样本数为3），CK869抑制剂组、CK666抑制剂组和溶剂对照组（样本数为2），分别进行相应处理，Transwell实验观察培养12 h后细胞移行。另取2批HT-29细胞，每批细胞均分为正常对照组、烧伤血清组和烧伤血清+rhITF组（样本数均为6），培养24 h后，蛋白质印迹法检测细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1（Rac1）及肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合亚基1B（ARPC1B）蛋白表达，活化磁珠下拉实验检测细胞Rac1活性。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、SNK检验。结果:每升发酵液获得rhITF 82.35 mg，蛋白纯度高达98%，且具有良好的抗原特异性。rhITF在胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中较稳定，与胰蛋白酶溶液作用2.0 h后仍有45%残余，与胃蛋白酶溶液作用4.0 h后仍有90%残余。假伤组小鼠伤后各时间点肠黏膜未见充血、水肿，单纯烧伤组小鼠伤后各时间点肠黏膜主要病理表现为充血、水肿、糜烂及出血。烧伤+rhITF组小鼠伤后3、5 d肠黏膜主要以充血、水肿为主，伤后7 d肠黏膜水肿和充血减轻。与单纯烧伤组比较，假伤组、烧伤+rhITF组小鼠伤后3、5、7 d肠组织DAO和LDH活性显著升高（ P<0.05或 P<0.01）。培养12 h后，25 μg/mL rhITF组细胞移行数为（58±12）个，显著多于阴性对照组的（16±5）个（ P<0.01），显著少于50 μg/mL rhITF组的（123±9）个（ P<0.05）。培养12 h后，烧伤血清组细胞移行数为（60±13）个，显著少于正常对照组的（143±11）个和烧伤血清+rhITF组的（138±8）个（ P<0.05）。培养12 h后，溶剂对照组细胞移行数为（155±9）个，明显多于CK666抑制剂组的（33±5）个、CK869抑制剂组的（28±5）个（ P<0.01）。培养24 h后，烧伤血清组细胞AMPK、Rac1蛋白表达量与正常对照组、烧伤血清+rhITF组相近（ P>0.05），p-AMPK蛋白表达量明显高于正常对照组、烧伤血清+rhITF组（ P<0.05或 P<0.01），ARPC1B蛋白表达量明显低于正常对照组、烧伤血清+rhITF组（ P<0.05）。培养24 h后，烧伤血清组细胞Rac1活性明显低于正常对照组、烧伤血清+rhITF组（ P<0.05或 P<0.01）。 结论:本研究获得的rhITF具有较高的纯度和超强的稳定性，能耐受极端pH和蛋白酶水解，减轻烧伤小鼠肠黏膜损伤。rhITF能通过抑制AMPK磷酸化维持Rac1-Arp2/3活性，促进肠上皮细胞移行，加速肠黏膜修复。

铁蛋白是普遍存在于各类有核生物、参与机体铁离子稳态调控的一类蛋白质,它可以自组装形成14 nm左右的中空笼状颗粒,常被作为药物和疫苗的递送载体.支原体铁蛋白的晶体结构显示,铁氧化活性中心和铁离子通道与其他物种存在结构上的差异.目前螺原体铁蛋白还未有相关研究.本研究发现,螺原体铁蛋白与包含支原体在内的其他物种铁蛋白均具有较低的同源性.利用大肠杆菌表达中华绒螯蟹螺原体铁蛋白(SeFer),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,蛋白能以可溶的形式表达于大肠杆菌细胞内.分别通过二乙氨基乙基(DEAE)弱阴离子交换层析、分子筛层析,获得高纯度的SeFer.在4℃和18℃,用坐滴气相扩散法对SeFer进行晶体筛选,该蛋白在多种条件下能生长晶体,通过同步辐射光源衍射,其晶体最好衍射至2.90 ?,属于I432空间群,收集的数据可用于后继结构解析.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)、动态光散射(DLS)以及SeFer分子筛出峰位置显示,经大肠杆菌重组表达的SeFer相对分子质量为400 kD左右,粒径大小为15 nm左右,与理论值接近.利用Alphafold 2对SeFer进行结构预测,发现其具有与其他铁蛋白类似的二十面体球状结构,但是其铁氧化活性中心与支原体铁蛋白保守位点存在差异.本结果不仅为研究SeFer的晶体结构提供了基础,也为疫苗载体提供了新的候选.

[目的]开发一种新型DNA测序酶,解决一代测序技术应对复杂DNA结构模板所面临的主要挑战,如测序信号中断或测序信号快速衰减.[方法]从NCBI数据库中挖掘到了Taq DNA聚合酶和单链结合蛋白SSB基因信息,利用遗传融合、定点突变及基因设计技术获得了一种新型的测序酶Sso-Sequenase.利用亲和层析和离子交换层析,获得了纯化的测序酶.利用抗体修饰技术改良了Sso-Sequenase的性能,并且利用STR技术对其热启动性能进行了表征.选取多组不同类型的复杂模板,采用一代技术对比分析了Sso-Sequenase测序酶试剂盒和传统BigDye测序试剂盒的测序表现.[结果]Sso-Sequenase在大肠杆菌中稳定表达,纯度达到 95%以上,产量高达 10.5 mg/L.当温度低于 35℃时,Sso-Sequenase表现出热启动活性.在复杂模板的一代测序反应中,如重复序列、高GC和发夹结构等样本,Sso-Sequenase测序酶成功完成了所有样本的测序,序列的平均碱基质量QV大于 20.相比而言,BigDye测序试剂盒在处理这些复杂样本时,多数样本测序信号出现了显著衰减或中断.[结论]开发了一种纯度好、产量高,兼具热启动活性的DNA测序酶Sso-Sequenase及测序试剂盒,显著提高了复杂DNA结构模板(重复序列、高GC和发夹结构)测序成功率.

目的:挖掘蜈蚣毒液中的电压门控钾离子通道Kv4.1多肽抑制剂,确定其一级结构,并对其空间结构进行建模分析.方法:利用离子交换层析和反相高效液相色谱对蜈蚣毒液的多肽组分进行分离纯化,通过全细胞膜片钳技术鉴定能够抑制Kv4.1通道的多肽;运用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱鉴定多肽的分子量,借助Edman降解测序和二维质谱测序确定多肽的一级结构;基于迭代线程装配细化在线分析建立多肽空间结构模型.结果:从蜈蚣毒液中分离纯化得到一条能够抑制Kv4.1通道的多肽SsTx-P2,分子量为6122.8,氨基酸序列为NH2-ELTWDFVRTCCKLFPDKSECTKACATEFTGGDESRLKDVWPRKLRSGDSRLKD-OH,其在1.0 μmol/L浓度下能够抑制Kv4.1通道超过95%的电流.空间结构模型显示,多肽SsTx-P2拥有一个保守的螺旋结构.结论:本文通过分离纯化从蜈蚣毒液中得到一条多肽SsTx-P2,能够强效抑制钾离子通道Kv4.1,其空间结构具有一定的保守性.

目的 分离五谷虫中蛆激酶,并对其进行生物活性评价.方法 采用盐析法、CM52 离子交换层析、苯甲脒亲和层析分离蛆激酶,利用纤维蛋白平板法测定其溶纤活性,通过丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟、抑肽酶判定其活性中心类型.结果 蛆激酶分子量为25 kDa,比活性933 262 U/mg,属于丝氨酸蛋白酶家族,具有分解纤维蛋白,激活纤溶酶原活性.结论 蛆激酶是一种具有降解纤维蛋白、激活纤溶酶原作用的多靶点溶栓酶.

将来源于Pseudomonas的多巴脱羧酶(DOPA decarboxylase,DODC)基因序列经过PCR扩增,双酶切,连接到载体CV6-pGEX-6P-1上,经验证、测序成功构建表达载体CV6-pGEX-6P-1-DODC.转入大肠杆菌BL21(DE3)重组表达,表达条件为OD值达到0.6～0.8,异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.1 mmol/L,16℃过夜培养12～16h.结果表明:在BL21(DE3)大肠杆菌中经诱导表达得到较高表达量的DODC融合蛋白;经过GST-亲和层析、3C蛋白酶切、离子交换层析得到纯度95％以上的DODC纯化蛋白;对DODC的酶学性质进行研究,该酶的最适反应温度为40℃,对温度的影响比较敏感,在20～30 ℃酶活在80％以上,超过30 ℃酶活大幅度降低,最适缓冲液为PBS缓冲液,最适反应pH值为7.5,最适底物为左旋多巴(L-DOPA),金属阳离子Ca2+对酶活力有促进作用.序列同源性分析表明,来源于Pseudomonas的DODC属于AAT-I超家族,并且预测出该酶的保守催化活性位点为Thr 241.

目的 开发一种他克莫司的分离提纯工艺.方法 采用离子交换树脂脱色除杂、纳滤、结晶等手段得到高质量的他克莫司粗粉,再经反相色谱硅胶层析、复合溶液结晶,得到符合USP标准的他克莫司精粉.结果 优选的脱色树脂为D002,所得他克莫司粗粉效价大于800μg/mg,二氢他克莫司含量小于4％;该粗粉经UniSil C8 Ultra Plus层析纯化,精粉含量大于99.5％,最大单杂小于0.1％.结论 该工艺操作简单、能耗低、收率高,适于他克莫司的产业化应用.