建立高效的大豆(Glycine max)转基因毛状根嵌合植株体系对于推动大豆功能基因组学研究具有重要意义.该研究利用3种大豆基因型材料比较了不同共培养条件下毛状根诱导率及成活率.结果显示,用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染外植体并在黑暗条件下共培养1天是诱导毛状根形成的有效策略.研究发现清除下胚轴处不定根可显著增加毛状根的数目并促进根系生长,进而提高转基因毛状根的阳性率.毛状根诱导14天接种根瘤菌,可增强生长初期转基因毛状根与根瘤菌的接触,从而提高大豆的结瘤效率.该研究成功建立了一种高效培育大豆转基因毛状根嵌合植株的方法,可广泛应用于大豆基因功能研究.

为了观察培育的外源嵌合基因gtfB-ctxB转基因生菜(防龃齿转基因生菜)传代生长情况,初步探索gtfB-ctxB基因在生菜中遗传的稳定性.田地种植T2、T3、T4代外源嵌合基因gtfB-ctxB生菜植株36,64,40株.在不同生长时期,随机选取植物不同组织部位为样本,用聚合酶链式反应技术检测gtfB-ctxB.T2、T3、T4代转基因生菜中均含有外源嵌合基因gtfB-ctxB,并且每代生菜中转基因生菜所占比例基本一样,都超过50％,其中T2代24株,T3代43株,T4代27株.并且3个连续世代植株阳性率间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).gtfB-ctxB外源基因在生菜下代中能高效表达,并且具有很好的遗传稳定性.

植物种群的多尺度集聚与聚块特征变化是植物对环境协同适应的结果.运用成对相关函数与零模型方法,依据微地形的土壤盐分分布规律设置4个样地,在2 m×2 m的样方内设置400个小格子记录植物株数并取土样,分析了兰州秦王川盐沼湿地土壤盐分梯度下角果碱蓬种群(Suaeda corniculata)种群空间格局的集聚分布内在特征.结果表明:角果碱蓬种群集聚分布范围内呈现2个关键尺度的集聚现象,小尺寸聚块的集聚或叠加形成复合大尺度聚集,整体表现为嵌套双聚块分布;随着土壤盐分递减,种群集群分布中大聚块尺寸趋于增大,小聚块尺寸差异不明显;大尺寸聚块的数量明显减少,小聚块数量随种群植株数量变化,整个梯度呈现降低趋势;小聚块中植株个体平均数逐渐减少,复合大聚块中包含小尺度聚块平均数量呈降低趋势.内陆盐沼湿地土壤环境异质性背景下角果碱蓬种群集群分布中聚块特征的梯度变化,是植株个体形态与构成的调整适应,种群正负向生态关系、庇护与自疏效应梯度转换的结果.

成簇的规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9)系统是近年来发展起来并被广泛应用的第三代基因组编辑工具.但是,该系统的酿脓链球菌Cas9(Streptococcus pyogenes,SpCas9)仅能识别NGG前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM),极大地限制了基因组编辑的范围.SpCas9变体VQR(D1135V/R1335Q/T1337R)在水稻中可识别NGAA、NGAG和NGAT PAM,但尚不清楚是否能识别NGAC PAM.本研究利用改进后的CRISPR/VQR系统对水稻中3个相对低效的VQR靶位点NAL1-Q1、NAL1-Q2和LPA1-Q进行了编辑,结果表明改进后的CRISPR/VQR系统可以高效编辑这3个靶位点,编辑效率分别为9.75％、43.90％和29.26％.为了明确改进后的CRISPR/VQR系统对NGAC PAM的识别情况,本研究选择水稻叶片宽度调控基因NARROW LEAF 1(NAL1)中的NAL-C位点和蜡质合成基因GLOSSY1(GL1)中的GL1-C位点进行基因编辑,并获得57株转基因水稻.靶位点PCR扩增及测序结果表明,NAL1-C和GL1-C靶标位点突变的植株分别为27株和44株,突变率分别为47.36％和77.19％;其中NAL1-C/GL1-C双突变植株为26株,双突变率为45.61％.进一步分析表明,CRISPR/VQR系统造成的突变有4种类型,分别为杂合突变、双等位突变、嵌合体突变和纯合突变,其中以杂合突变和双等位突变为主.这些结果表明,改进的CRISPR/VQR系统可以高效编辑水稻NGAC PAM位点,并产生丰富的突变类型.本研究为水稻及其他植物相关基因NGAC PAM位点的编辑提供了理论依据.

为了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化,该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因(2A11-iaaM)过量表达载体,以罗汉果雌株叶盘为材料,采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系,转化和创制单性结实罗汉果种质,通过基因特异引物对的PCR扩增,初步检测出转基因阳性植株,将之移栽大田,观察转基因植株的单性结实性的表现.结果表明:构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系,即农杆菌菌液OD600值为0.3～0.5,侵染10 min,最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg?L-1+IBA 0.5 mg?L-1+Kan 5 mg?L-1+Cef 300 mg?L-1;经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间,经田间调查发现,24株阳性扩繁植株中有5株正常开花,占总植株数的20.8％,且其子房未经人工授粉发育成幼果,表现单性结实性.在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上,将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达,为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理,创制转基因罗汉果单性结实新种质,以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础.

类伸展蛋白(Leucine-Rich Repeats Extensins,LRX)是一类细胞壁嵌合蛋白,其N端包含一个LRR(leucine-rich repeats)结构域,C端含Extensins结构域.研究表明,LRX基因家族在拟南芥(Arabidopsis thaliana)花粉萌发和花粉管生长过程中具有重要作用,而水稻(Oryza sativa L.)LRX基因家族是否在调控花粉发育方面具有保守的生物学功能尚不清楚.本研究首先进行了生物信息学分析,结果显示,水稻LRX基因家族包括8个成员,OsPEX3、OsLRX3、OsLRX5位于水稻第1号染色体;OsLRX1、OsLRX3、OsLRX2、OsPEX1和OsPEX2分别位于第2、第5、第6、第11和第12号染色体,其中OsPEX1基因在花粉中高表达,暗示OsPEX1可能参与了花粉发育调控.为此,本研究采用RNAi技术进一步研究了OsPEX1基因对花粉发育的影响.结果表明,OsPEX1基因的RNAi转基因植株花粉败育,结实率仅为10％-30％.qRT-PCR分析显示,这些RNAi转基因植株OsPEX1基因表达量显著低于野生型,而且其表达量越低花粉育性亦随之降低.上述研究结果表明,水稻OsPEX1基因是水稻花粉发育的重要基因,该基因的克隆和功能分析有助于进一步阐明水稻花粉发育调控的分子遗传学机制.

植物体细胞染色体数目减少是一种罕见现象.本研究以同一份橡胶树野生种质的四倍体和嵌合体为材料,通过流式细胞术分析嵌合体中四倍体细胞比例的位置效应,利用SSR分子标记分析四倍体和嵌合体的来源途径.结果表明,嵌合体植株四倍体细胞的比例在第一蓬叶处为80.50％,在第七蓬叶位置的比例为65.58％,嵌合体中四倍体细胞比例随着植株的生长而下降.18对引物在四倍体和嵌合体中扩增出的32条带完全一致,与嵌合体的二倍体砧木中的扩增结果有28条差异条带,表明嵌合体来源于四倍体体细胞的自然减倍.18个位点中1个位点的2个等位基因相对扩增产物量为3:1,表明该四倍体种质资源不是体细胞染色体加倍形成的同源四倍体,而是由2n卵细胞和2n花粉经有性多倍化途径形成的异源四倍体.本研究首次发现并证实了橡胶树异源四倍体体细胞减倍现象.

白羽扇豆(Lupinus albus)是研究耐低磷机制的模式作物,然而遗传转化体系的缺乏极大限制了其功能基因组学研究.本试验以白羽扇豆品种'Amiga'为材料,研究不同发根农杆菌菌株对白羽扇豆毛状根诱导率和阳性转化率的影响.结果 发现K599为白羽扇豆发根遗传转化的最适菌种,进而确立了一套高效的白羽扇豆毛状根转化体系,并成功获得增强型绿色荧光蛋白基因EGFP (ENHANCED GREEN FLUO-RESCENT PROTEIN)在白羽扇豆毛状根中过表达的嵌合植株.该遗传转化体系的建立为白羽扇豆功能基因组学研究提供了强有力的方法支撑.

背景:转基因植物可食性疫苗是以植物作为载体,将外源性基因整合到植物基因组当中,进一步激活动物或人体免疫系统以获得特异性免疫能力.但外源性基因的持续低表达量一直无法达到满意的免疫效果.目的:用分子生物学技术检测转基因番茄植株中pacA-ctxB融合基因表达及目的蛋白的表达量,为进一步观察可食用防龋疫苗的防龋效果提供研究基础.方法:①提取转基因番茄叶片总DNA,PCR检测外源性融合基因pacA-ctxB,实验分组3组:阳性对照组为质粒p2355-EPC10;空白对照组为普通番茄1株(红抗219);转基因组为转基因番茄9株;②BCA法检测转基因番茄果肉中总蛋白的水平;Western blot证实转基因番茄果实中PAcA/CTB目的蛋白的表达,目的蛋白检测分组2组:转基因组为表达外源性嵌合基因的转基因番茄5株(PCR检测阳性);空白对照组为普通番茄1株;酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测转基因番茄果实中PAcA/CTB目的蛋白浓度.结果 与结论:①PCR扩增结果可见9株转基因番茄中有5株出现约1.7 kb特异性扩增条带,占总检测植株的55％;②转基因番茄总蛋白为3.15 g/L;Western blot可见PCR检测为阳性的转基因番茄蛋白提取样本在分子质量约为58 kD处均出现了高密度条带,非转基因番茄蛋白样本未见特异条带;ELISA测得目的蛋白表达量约4.12 mg/L,占番茄可溶性总蛋白的0.13％;③结果说明,外源性融合基因pacA-ctxB能够在番茄植株中表达及产生目的蛋白.

遗传转化是植物基因工程的重要手段.快速、高效地将目的基因导入植物细胞,并缩短获得转基因后代的时间是遗传转化的关键.花生(Arachis hypogaea)是我国重要的油料及经济作物.目前花生的遗传转化体系尚未完善,制约着花生的基因功能解析和分子育种进程.该文建立了一套快速、稳定的花生遗传转化体系.通过将农杆菌注射于花生第2茎节的切面获得转化植株,再将阳性植株进行移栽和回土,采摘注射点以上的荚果进行后续鉴定与分析.结果表明,利用该方法可获得40％以上的T0代嵌合体植株,约5个月可收获T0代花生种子,其中约有9％的T1代花生植株为非嵌合体的杂合体.针对部分转基因植株结实少的问题,进一步提出了将快速转化体系与传统组培方法相结合的优化方案.构建的快速转化方法对大蒜(Allium sativum)、马铃薯(Solanum tuberosum)和香雪兰(Freesia refracta)的遗传转化具有潜在应用价值,对其它植物的遗传转化也有重要参考价值.