穿心莲为我国重要的南药之一,用于清热解毒、凉血消肿,其主要活性成分穿心莲内酯具有抗癌、抗HIV病毒、抗炎、保肝等功效.然而,穿心莲内酯人工合成难度较大,主要从人工栽培的植物原料中提取,栽培植物原料的质量因受土壤、气候、水肥管理等各种因素的影响而参差不齐,穿心莲生长周期长且占用土地资源.植物离体培养技术在种苗快繁及活性成分积累等方面都具有显著优势,是实现穿心莲活性成分快速、高效生产的重要途径之一.穿心莲组织离体再生技术体系日益完善,从外植体到完整植株的组织离体再生技术日渐成熟,已在种苗繁育、倍性育种等方面有了一定的应用.同时,在穿心莲愈伤组织培养、细胞悬浮培养、不定根培养、毛状根培养过程中,通过优化培养条件和使用适宜的诱导子可大幅增加培养物中穿心莲内酯等活性成分的积累.该文分别从穿心莲组织、细胞、不定根及毛状根培养等方面,全面系统地综述了近年来国内外关于穿心莲离体培养技术以及其生产穿心莲内酯的研究进展,以期促进穿心莲离体培养技术的发展与应用,为离体生产穿心莲内酯的研究提供参考.此外,还提出了未来在穿心莲离体培养技术及通过该技术生产穿心莲内酯的研究中需重点关注的 3 个方面:(1)熟化完善穿心莲组织离体再生技术体系,建立全面系统的评价体系;(2)优化培养条件和高效诱导子联用,进一步提高穿心莲内酯等重要活性成分产量;(3)开展通过细胞悬浮培养技术生产穿心莲内酯的生物反应器培养研究.

目的 克隆获得丹参SmCYP76S7 基因序列,并对其进行生物信息学和表达特性分析.方法 克隆获得SmCYP76S7的 cDNA 及基因组 DNA 序列,运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析.构建融合表达载体pEGAD-SmCYP76S7-eGFP,转化烟草后分析SmCYP76S7 蛋白的亚细胞定位.利用qRT-PCR测定SmCYP76S7 基因在各器官中的表达量,同时分别利用不同光质和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理丹参幼苗和丹参毛状根,探究SmCYP76S7基因对光质和MeJA的响应.结果 SmCYP76S7 基因包含 2个外显子和 1 个 1 506 bp的开放阅读框,编码 501 个氨基酸.该基因在根、茎、叶和花中均有表达,其中花中表达量最低.SmCYP76S7 蛋白除定位于内质网外,还分布于多个细胞结构.SmCYP76S7 基因的表达在红光处理和MeJA处理样品中显著上调,是典型的光和MeJA诱导基因.结论 SmCYP76S7 基因是CYP76 家族成员,结合其表达特性和同家族其他成员的催化活性,该蛋白很可能参与丹参酮类成分的生物合成,其具体的生物学作用值得进一步深入挖掘.

由于工业发展以及生活废弃物污染的不断加剧,作物中的重金属浓度超标,严重威胁人体的健康.铝激活苹果酸转运体编码一类阴离子通道蛋白,在植物有机酸的跨膜转运中发挥重要的作用.为研究GmALMT33基因在大豆应对镉胁迫中的功能,本研究以大豆黑农48的叶片cDNA为模板,利用RT-PCR克隆得到GmALMT33基因.该基因CDS区全长1622 bp,编码553个氨基酸,含有1个ALMT结构域.qRT-PCR结果表明,GmALMT33在大豆根部的表达水平最高;镉胁迫后,该基因表达量呈现先升高后降低的趋势.构建植物表达载体pCPB-GmALMT33并对烟草、大豆毛状根进行遗传转化,转基因植株抗逆表型与生理指标分析表明,镉(66pmol/LCdCl2)胁迫下,转基因烟草叶片黄化、褪绿,边缘褐化程度明显低于野生型烟草.转基因大豆毛状根复合体植株茎秆和叶脉呈现的红褐色毒害症状程度明显弱于转空载体植株.在镉胁迫处理7d后,转基因烟草叶片的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性及可溶性糖含量均高于野生型对照,丙二醛含量均低于对照.在镉胁迫处理0 d、1 d、3 d后,转基因大豆毛状根复合体根和叶的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性、可溶性糖含量均高于转空载体对照,丙二醛含量均低于对照,表明GmALMT33基因提高了植株的耐镉能力.本研究为进一步探讨GmALMT33基因的作用机制提供了依据,并为大豆抗逆育种提供了新的基因.

我国盐碱地分布广、面积大,是重要的后备耕地资源、粮食增产的"潜在粮仓".挖掘负调控大豆耐混合盐碱性的基因,通过基因敲除创制耐混合盐碱大豆新品种,是合理开发利用盐碱地,提高我国大豆产量的有效途径之一.课题组前期筛选到1个混合盐碱胁迫下调表达的基因Glyma.02g271000(GmDUF247-1).其编码的GmDUF247-1蛋白包含1个DUF247结构域和1个跨膜结构域,利用烟草叶片瞬时表达发现GmDUF247-1-GFP融合蛋白定位在细胞膜上.荧光定量PCR显示,GmDUF247-1基因在大豆根中表达量最高,在混合盐碱处理下显著下调.为研究GmDUF247-1在大豆混合盐碱胁迫下的功能,利用大豆毛状根系统过表达GmDUF247-1基因,发现混合盐碱胁迫处理后,GmDUF247-1过表达大豆毛状根复合植株叶片萎蔫程度明显高于空载体对照,存活率、根长和株高显著低于对照.对GmDUF247-1基因在大豆自然群体中的单倍型分析发现,其启动子区有8个SNPs和4个InDels,可能导致与逆境应答和生长发育相关的转录因子识别元件序列发生改变;CDS区存在3种单倍型,GmDUF247-1H1基因型受到了明显的人工选择.本研究初步明确了 GmDUF247-1基因负调控大豆混合耐盐碱性,为系统研究GmDUF247-1基因功能和育种利用奠定了研究基础.

以黑农37(感)和东农L10(抗)大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫RNA-seq数据,筛选出差异表达基因GmSBPC,对该基因编码蛋白的空间结构、蛋白理化性质、亲疏水性等进行生物信息学分析.利用抗病东农L10根系cDNA克隆GmSBPC.将含有pCAMBIA1302-GmSBPC重组载体转化至大肠杆菌DH5a、农杆菌GV3101(psoup-p19)进行亚细胞定位分析.重组pCAMBIA3300-GmSBPC转至根癌农杆菌K599进行大豆毛状根侵染.线虫土种植东农L10(抗)、东农50(感),大豆胞囊线虫胁迫处理0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d分别取根、茎、叶进行qRT-PCR分析基因表达模式.结果表明,GmSBPC蛋白编码146个氨基酸,为不溶性蛋白,α螺旋区占28.08％、延伸结构占15.75％、无规则卷曲占56.16％.亚细胞定位结果表明基因定位在细胞核中.过表达毛状根相比野生型大豆单位面积内线虫数目减少.大豆胞囊线虫胁迫下该基因在东农50和东农L10根系的表达模式为先升高后降低,整体表达水平东农L10根系＞东农50根系,东农L10根系中12 d表达量最高,该时期为线虫侵染大豆的二龄幼虫时期,因此判定该基因对线虫胁迫存在响应应答反应,推测该基因参与大豆胞囊线虫的胁迫反应.这些研究结果有助于进一步探讨SBPC基因在大豆抗胞囊线虫过程中的生理功能.

鲜食风味是影响菜用大豆食味品质的关键因素,其形成与有机酸有着密切的关联,研究有机酸合成机制对于菜用大豆的品质改良具有重要的实际意义.本研究利用大豆毛状根系统,探究与苹果酸含量显著相关的候选基因GmALMT8、GmIF7GT5和GmAP在调控苹果酸含量方面的功能,结果表明:在GmALMT8-OE毛状根中,GmALMT8基因表达量与苹果酸的含量均显著高于空载对照毛状根,而GmIF7GT5和GmAP毛状根中苹果酸的含量无显著变化.鉴于已经报道的ALMT家族基因的苹果酸转运功能,推测大豆中GmALMT8基因可能具有相似的功能,在调控苹果酸含量方面发挥重要作用.为验证GmALMT8-OE毛状根中苹果酸含量的变化是否由GmALMT8 基因表达的改变所引起,本研究采用蘸花法在拟南芥中过表达GmALMT8基因.与阳性毛状根中苹果酸测定的结果相类似,过表达GmALMT8显著提高了 T2代转基因拟南芥株系种子中的苹果酸含量,进一步证明GmALMT8的稳定表达能够提高苹果酸含量,明确GmALMT8基因在大豆中具有调控苹果酸含量的生物学功能,丰富了大豆有机酸的理论研究,对菜用大豆优质育种具有参考价值.

建立高效的大豆(Glycine max)转基因毛状根嵌合植株体系对于推动大豆功能基因组学研究具有重要意义.该研究利用3种大豆基因型材料比较了不同共培养条件下毛状根诱导率及成活率.结果显示,用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染外植体并在黑暗条件下共培养1天是诱导毛状根形成的有效策略.研究发现清除下胚轴处不定根可显著增加毛状根的数目并促进根系生长,进而提高转基因毛状根的阳性率.毛状根诱导14天接种根瘤菌,可增强生长初期转基因毛状根与根瘤菌的接触,从而提高大豆的结瘤效率.该研究成功建立了一种高效培育大豆转基因毛状根嵌合植株的方法,可广泛应用于大豆基因功能研究.

植物毛状根是药用成分的天然优质原料,具有生长快速、生产时间短、次生代谢产物产量高、遗传稳定等优点,目前利用毛状根技术高效生产药用原料和改良药用植物品质已经成为研究热点.该文总结了与毛状根中药用成分合成途径及其调控方式相关的研究资料,发现目前提高药用植物毛状根中次生代谢物含量的途径一是改变毛状根的外在培养条件,二是对毛状根内在的次生代谢物生物合成通路进行调控;而有关毛状根次生物质代谢合成调控机制的研究主要集中于双子叶草本植物中,以研究生物碱类、黄酮类、皂苷类、萜类、苯丙素类和蒽醌类药用活性成分生物合成的调控机制为主,其中对丹参毛状根中丹参酮和甘草毛状根中甘草酸的生物合成调控机制进行了深入研究.该综述主要从调控毛状根药用成分生物合成的关键酶基因、转录因子以及新颖分子调控因子三个方面进行了系统总结,为药用植物毛状根次生代谢产物合成调控与生产提供参考.

前期苦荞转录组分析显示了一个介导黄酮类物质合成相关的黄酮合成酶基因FtFLS1.为进一步了解FtFLS1基因的结构、功能和基因多样性,本研究通过同源比对和保守序列分析筛选得到苦荞FLS基因家族共104个成员,其根据同源性和结构域分为10个亚族,FtFLS1属于DF8亚族.同时,启动子分析结果显示上游1500 bp启动子序列中有2个MeJA响应元件,据此,本研究分析了FtFLS1在苦荞不同器官中的表达量差异及其在MeJA不同处理时间下苦荞中的表达量差异,结果显示,FtFLS1在茎和叶中的表达相近且均要明显高于其在根中的表达,同时FtFLS1在苦荞中的表达也随着MeJA处理时间的增加而显著提高.为进一步验证FtFLS1的功能,本研究克隆了FtFLS1的CDS序列,以此构建FtFLS1的过表达苦荞毛状根株系并检测了它们的黄酮类物质含量,结果显示,相对于正常诱导的苦荞毛状根,FtFLS1的过表达毛状根明显积累了3类黄酮合成酶的下游产物:山奈酚、槲皮素和芦丁,而黄酮合成酶的底物二氢山奈酚和二氢槲皮素的含量明显降低.此外,本研究还分析了200份不同群体苦荞中FtFLS1基因的多样性,结果显示:北方群体、南方群体和喜马拉雅野生群体均拥有明显不同的FtFLS1基因型分布,其中北方群体和南方群体呈现明显的分化,研究结果为探索FtFLS1介导的黄酮类物质合成以及了解荞麦驯化过程提供了思路和参考.

目的 考察生物诱导子酵母提取物(YE)和非生物诱导子银离子(Ag+)复合诱导子对不同处理时间丹参毛状根生长量和初次生代谢产物积累的综合性影响.方法 在继代培养21d的丹参毛状根中添加YE+Ag+复合诱导子,分别测定诱导后0、2、4、6、8、10 d后丹参毛状根的生长量,采用紫外分光光度法和超高效液相色谱法测定丹参毛状根体内初次生代谢产物的含量.结果 在实验浓度条件下,与空白对照组相比,YE+Ag+对毛状根生长有明显的抑制作用,且抑制了初生代谢产物总糖和总蛋白的积累.YE+Ag+明显促进了毛状根中次生代谢产物总酚酸类和总丹参酮类的积累,其中咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量分别为空白对照组的2.22、7.47、2.39、32.15、7.65和52.89倍.结论 YE+Ag+协同作用抑制丹参毛状根的生长,同时对不同成分的积累具有不同的影响,抑制初生代谢产物的积累,促进次生代谢产物的积累.