目的:基于单细胞转录组测序分析百草枯（PQ）诱导的帕金森病（PD）样小鼠大脑小胶质细胞亚群差异基因和相关信号通路，为阐明PQ致动物大脑PD样改变的机制研究提供线索。方法:于2021年9月，将6周龄C57BL/6雄性小鼠6只随机分为对照组和实验组（每组3只），分别以生理盐水、10.0 mg/kg PQ进行腹腔注射，每3天1次，连续10次注射造模。染毒结束后取小鼠大脑，进行10× Genomics单细胞转录组测序。根据基因表达特征筛选小胶质细胞亚群，进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。进一步筛选实验组和对照组间小胶质细胞亚群的差异基因，利用生物信息学工具进行功能显著性富集分析。采用0、60、90 μmol/L的PQ溶液处理小鼠小胶质细胞（BV2细胞），通过实时荧光定量PCR实验验证差异基因己糖激酶2（Hk2）、ATPase H+转运V0亚基b（Atp6v0b）、神经调节蛋白1（Nrg1）的表达情况。结果:根据特征基因肌醇多磷酸-5-磷酸酶d（Inpp5d）和转化生长因子β受体1（Tgfbr1）将Cluster 7和Cluster 20亚群识别为小胶质细胞亚群，且该亚群反映小胶质细胞活化M2表型。生物信息学分析结果显示，所识别小胶质细胞亚群特征基因均富集到内吞作用；在分子功能方面主要富集跨膜受体蛋白激酶活性和细胞因子结合等功能。Cluster 7亚群上调基因主要富集于溶酶体通路、内吞作用等通路；下调基因主要富集于神经退行性疾病等信号通路。Cluster 20亚群上调基因主要富集于与PD相关的信号通路；下调基因主要富集于环磷酸腺苷（cAMP）信号传导途径、神经系统发育、突触功能等信号通路。实时荧光定量PCR检测结果显示，与0 μmol/L比较，90 μmol/L PQ溶液处理后BV2细胞的Hk2 mRNA和Atp6v0b mRNA表达水平升高，Nrg1 mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:小胶质细胞在PQ诱导的PD样小鼠模型中被激活，且向M2表型极化，其功能与溶酶体（内吞）、突触功能及PD相关信号通路的调节有关。

目的:探究外源性乳酸对Raw264.7细胞、小鼠骨髓来源巨噬细胞(mouse bone marrow-derived macrophages，BMDMs)及THP-1细胞中登革病毒2型(dengue virus type 2，DENV-2)复制的影响及乳酸与细胞活化之间的关系。方法:培养和诱导BALB/c小鼠骨髓中的BMDMs，流式细胞术检测F4/80 ＋CD11b ＋细胞纯度。qRT-PCR检测不同时间点DENV-2感染BMDMs中葡萄糖转运体1(glucose transporter type 1，GLUT1)、己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)、乳酸转运体4(monocarboxylate transporters 4，MCT4)的mRNA表达水平，比色法检测细胞上清液中乳酸含量。使用CCK-8法评估不同浓度乳酸对Raw264.7细胞、BMDMs及THP-1细胞活力的影响，qRT-PCR检测不同浓度乳酸对不同MOI DENV-2感染细胞中病毒E基因、CD163、TGF-β、CD86、视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)、IFN-β、干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15，ISG15)及ISG56的mRNA表达水平，流式细胞术检测CD86和CD206蛋白的表达。 结果:BMDMs纯度为(87.53±1.66)%。DENV-2(MOI＝3)感染BMDMs后，GLUT1 mRNA转录水平在12 h一过性增高，在24 h降低( P<0.05)，而HK2 mRNA转录水平在12、24和36 h均高于空白对照组和灭活DENV-2组( P<0.01)；DENV-2(MOI＝1.5)感染后24 h，MCT4 mRNA转录水平及上清液中乳酸含量均上升( P<0.05)。CCK-8结果显示当乳酸浓度为31.25 mmol/L时，上述3种细胞的活力均大于80%。qRT-PCR结果显示，在MOI＝1和2时，35 mmol/L乳酸可增加BMDMs中DENV E基因mRNA的表达水平( P<0.05)；在MOI＝1.5时，35 mmol/L乳酸上调Raw264.7和THP-1细胞中的DENV E基因mRNA表达水平( P<0.001)，以及BMDMs中CD163、TGF-β、RIG-Ⅰ、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表达水平( P<0.05)，下调CD86 mRNA的表达( P<0.05)，细胞中CD206蛋白的表达增加( P<0.01)，而CD86蛋白的表达下降( P>0.05)。 结论:本研究发现外源性乳酸能促进DENV-2在人源及鼠源巨噬细胞中的感染，该现象与细胞M2型极化有关。

目的:观察电针足三里穴预处理脓毒症心肌损伤小鼠心肌组织中5-羟色胺（5-HT）水平的变化，探讨电针在脓毒症心肌损伤中发挥的保护效应及可能机制。方法:按随机数字表法将20只雄性C57BL/6小鼠分为对照组（NC组）、脓毒症模型组（LPS组）、电针组（EA组）、电针加氟西汀组（EA+FLU组），每组5只。采用腹腔注射脂多糖（LPS）10 g/L的方法建立脓毒症心肌损伤小鼠模型；NC组腹腔注射等量生理盐水。制模前3 d，EA组和EA+FLU组电针双侧足三里穴15 min，每日1次，连续3 d；EA+FLU组在电针前腹腔注射氟西汀1.4 g/L。制模后，苏木素-伊红（HE）染色观察心肌组织病理学改变；检测血清中炎症因子白细胞介素（IL-6、IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，心肌内5-HT含量，心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平，以及心肌组织中三磷酸腺苷（ATP）、乳酸含量；定量聚合酶链反应（qPCR）检测心肌组织5-羟色胺转运体（5-HTT）、己糖激酶2（HK2）、葡萄糖转运体4（GLUT4）的mRNA表达；免疫荧光法检测心肌组织中GLUT4的表达。结果:与NC组相比，LPS组和EA+FLU组血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量，心肌内5-HT含量，心肌组织损伤标志物CK-MB、cTnI含量均明显升高。与LPS组相比，EA组上述指标均明显下降〔IL-6（ng/L）：443.03±156.16比19?843.75±0.00，IL-1β（ng/L）：75.72±10.60比894.66±350.88，TNF-α（ng/L）：46.17±4.71比533.01±170.58，5-HT（μg/L）：161.19±5.96比244.74±14.38，CK-MB（ng/L）：468.21±12.46比662.02±22.54，cTnI（ng/L）：0.83±0.05比0.99±0.08，均 P<0.05〕。与NC组相比，LPS组、EA组和EA+FLU组心肌组织ATP水平均明显下降，乳酸水平均明显升高。与LPS组相比，EA组心肌组织ATP水平明显上升，乳酸水平明显下降〔ATP（mmol/L）：0.10±0.01比0.08±0.01，乳酸（mmol/L）：56.03±1.07比72.45±4.32，均 P<0.05〕。与NC组相比，LPS组心肌组织HK2 mRNA表达明显上升，GLUT4、5-HTT mRNA表达明显下降。与LPS组相比，EA组心肌组织HK2 mRNA表达明显下降，GLUT4、5-HTT mRNA表达明显上升〔HK2 mRNA（相对表达量）：0.73±0.19比1.82±0.57，GLUT4 mRNA（相对表达量）：1.00±0.33比0.47±0.18，5-HTT mRNA（相对表达量）：1.18±0.31比0.38±0.15，均 P<0.05〕。与NC组相比，LPS组和EA+FLU组GLUT4荧光强度明显减弱。与LPS组相比，EA组GLUT4荧光强度明显增强。 结论:电针足三里穴预处理可减少脓毒症小鼠心肌组织中5-HT含量，其调控机制可能与调节5-HTT和GLUT4有关。

目的 研究蠲瘤散结方对肺腺癌A549细胞增殖和糖酵解得影响,并探讨其潜在的分子机制.方法 CCK-8法(cell counting kit-8,CCK-8)检测不同浓度蠲瘤散结方(2、4、6、8、10、12 mg·mL-1)处理A549细胞24 h和48 h后的细胞活力.将A549细胞分为对照组和蠲瘤散结方低、高(3、6 mg·mL-1)浓度组,加药干预24 h,细胞克隆形成实验检测A549细胞增殖情况;流式细胞术检测A549细胞周期;试剂盒检测细胞上清液中葡萄糖消耗量、乳酸生成水平;测量仪检测细胞上清液酸碱度(potential of hydrogen,pH值);实时荧光定量逆转录PCR(real-time RT-PCR,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)、磷酸化的蛋白激酶 B(phosphorylation protein ki-nase B,p-AKT)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1 α,HIF-1α)、葡萄糖转运体 1(facilitative glucose trans-porter,Glut 1)、己糖激酶2(hexokinase2,HK2)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2)、乳酸脱氢酶 A(lactate dehydrogenase A,LDHA)基因和蛋白的表达.使用AKT激活剂后,试剂盒检测细胞上清液液中葡萄糖消耗量、乳酸生成水平;pH测量仪检测细胞上清液pH值;CCK-8检测A549细胞增殖,RT-qPCR和 Western blot检测AKT(p-AKT)、Hif-1α、Glut1、HK2、PKM2、LDHA基因和蛋白的表达.结果 蠲瘤散结方抑制A549细胞增殖(P＜0.05),与对照组比较,蠲瘤散结方低、高(3、6 mg·mL-1)浓度组细胞克隆形成率降低(P＜0.05,P＜0.01),G0/G1期细胞比率下降(P＜0.05,P＜0.01),细胞上清液中葡萄糖消耗量以及乳酸生成量下降(P＜0.05,P＜0.01),AKT(p-AKT)、Hif-1α、Glut1、HK2、PKM2、LDHA基因和蛋白的表达下降(P＜0.05,P＜0.01).使用AKT激活剂后,与蠲瘤散结方高浓度组比较,蠲瘤散结方联合AKT激活剂用药组细胞上清液葡萄糖消耗量和乳酸生成量上升(P＜0.05,P＜0.01),pH值下降(P＜0.05),细胞增殖活力上升(P＜0.05),AKT(p-AKT)、Hif-1α、Glut1、HK2、PKM2、LDHA基因和蛋白的表达上升(P＜0.05).结论 蠲瘤散结方对A549细胞的增殖和糖酵解具有抑制作用,其机制可能与调控AKT信号通路有关.

探究楹树皂苷对乙醇致大鼠急性胃溃疡的保护作用及其机制.SD大鼠实验前 24 h禁食不禁水,正常对照组和模型组灌胃水,阳性药组灌胃雷贝拉唑钠溶液(40 mg·kg-1),受试物组灌胃不同剂量的楹树皂苷溶液(3、10、30 mg·kg-1),30 min后正常对照组灌胃 1.5 mL水,其余各组均灌胃等体积 95%乙醇造模,6 h后颈椎脱臼法处死大鼠取胃.统计出血面积,计算溃疡指数;苏木素-伊红(HE)染色检测胃组织病理改变;高碘酸-席夫(PAS)染色检测胃黏膜表面黏液分布;酶联免疫吸附法(ELISA)检测胃黏膜磷脂和氨基己糖含量;Western blot检测胃组织碳酸氢根转运体、基质金属蛋白酶和细胞间紧密连接相关蛋白表达量;免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色检测分泌型黏蛋白和紧密连接相关蛋白阳性细胞.结果显示正常对照组大鼠胃组织表面光滑无出血点,模型组大鼠胃溃疡指数为 35±11,楹树皂苷在 3、10、30 mg·kg-1剂量下对大鼠胃溃疡的抑制率分别为 46%(P<0.01)、85%(P<0.001)、100%(P<0.001).模型组大鼠胃黏膜结构破坏严重,无法观察到黏液层.与模型组相比,楹树皂苷组大鼠胃黏膜表面黏液层完整,黏液中磷脂和氨基己糖含量显著增加,分泌型黏蛋白MUC5AC阳性细胞数明显增多,碳酸氢根转运体SLC26A3 和CFTR的表达水平显著提高,应激活化蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶(JNK)和核转录因子c-Jun磷酸化显著减少,基质金属蛋白酶(MMP)-8 表达量明显降低,同时检测到MMP-8 内源性抑制剂(TIMP-1)表达升高,紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达量明显增加.结果表明楹树皂苷一方面通过上调分泌型黏蛋白MUC5AC以及磷脂和氨基己糖含量,同时提高碳酸氢根转运体SLC26A3 和CFTR的表达水平来增强黏液-碳酸氢盐屏障功能;另一方面通过抑制JNK信号通路,阻止MMP-8过度活化,从而减少Occludin和ZO-1的降解来增强黏膜屏障功能.即楹树皂苷在黏液屏障和黏膜屏障 2 个方面共同发挥抗胃溃疡的作用.

基于整合药理学和实验验证探讨健脾除痰解毒方(Jianpi Chutan Jiedu Decoction,JCJD)干预肺癌的作用机制.采用中医药整合药理学研究平台(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medi-cine,TCMIP)V2.0,检索并获取健脾除痰解毒方靶标及功能信息,以及肺癌疾病靶标及功能信息,借助中医关联网络挖掘平台构建"疾病-方剂"关联网络,并通过网络拓扑特征计算、自定义多维关联网络可视化(方剂-中药材-核心靶标-通路-疾病)以及基因本体(GO)功能和依托Reactome数据库的Pathway信息进行富集分析,发现健脾除痰解毒方干预肺癌的关键网络靶标及其作用机制.最后通过动物实验进一步验证整合药理学结果.结果共获得健脾除痰解毒方干预肺癌的核心靶标53个;GO富集分析得到生物过程有20种条目,细胞组分有11种条目,分子功能有20种条目;Reactome Pathway富集分析得到11个条目,主要涉及呼吸电子传递、TP53调节代谢基因、细胞内受体的SUMO化、白细胞介素(IL)-4和IL-13通路等信号通路.动物实验结果显示与模型组比较,联合组肿瘤组织中乳酸含量明显下降(P＜0.05),联合组可明显上调肿瘤组织中磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)蛋白平均光密度值(P＜0.05),降低丙酮酸激酶M2(PKM2)和己糖激酶2(HK2)蛋白平均光密度值(P＜0.05);与模型组比较,联合组可明显上调肿瘤组织中肿瘤抑制蛋白(P53)、PTEN mRNA及蛋白表达(P＜0.01,P＜0.05),降低肿瘤组织中TP53诱导的糖酵解与凋亡调控因子(TIGAR)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、PKM2、HK2 mRNA及蛋白表达(P＜0.01).综上,健脾除痰解毒方通过TP53调节代谢基因来下调葡萄糖代谢,从而抑制肺癌增殖.

目的 探讨萝卜硫素(SFN)调节花生四烯酸 5-脂氧合酶基因(arachidonic acid 5-lipoxygenase,ALOX5)/核因子kappa B(NF-κB)信号通路调节巨噬细胞糖酵解对糖尿病肾病(DN)进展的影响.方法 生物信息学分析SFN治疗DN的靶基因.使用30 mmol/L高葡萄糖(HG)处理人近端肾小管上皮细胞系(HK-2 细胞)诱导体外DN模型.将HK-2 细胞分为如下组:正常糖(NG)组、HG组、HG+SFN(3 mmol/L)组、HG+ALOX5 组、HG+SFN(3 mmol/L)+ALOX5 组、HG处理的巨噬细胞+HK-2 细胞组、HG+SFN(3 mmol/L)处理的巨噬细胞+HK-2 细胞组、HG+ALOX5 转染处理的巨噬细胞+HK-2 细胞组、HG+SFN(3 mmol/L)+ALOX5 转染处理的巨噬细胞+HK-2 细胞组.CCK-8 检测细胞活力,原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;葡萄糖和乳酸试剂盒检测各组细胞中葡萄糖和乳酸水平;Western blot检测各组细胞中ALOX5、NF-κB以及糖酵解相关蛋白己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达;使用链脲佐菌素(STZ)构建DN小鼠模型,DN小鼠给与SFN(0.5 mg/kg)治疗;检测小鼠各项生化指标,HE染色检测肾组织病理变化;Western blot检测小鼠肾脏巨噬细胞中糖酵解相关蛋白己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、葡萄糖转运蛋白 1(GLUT1)的表达.结果 生物信息学分析结果显示 ALOX5 是 SFN 治疗DN的靶基因.与HG组相比,SFN处理增强HK-2 细胞活力并抑制细胞凋亡(P<0.05);同时,SFN处理抑制HG诱导的巨噬细胞糖酵解相关蛋白的表达,减弱巨噬细胞介导的HK-2 细胞损伤(P<0.05);Western blot 结果表明 SFN 抑制ALOX5 和NF-κB 的表达(P<0.05);小鼠实验结果显示,SFN治疗改善DN小鼠肾功能和肾组织病理学改变,抑制肾组织中巨噬细胞糖酵解相关蛋白的表达(P<0.05).结论 SFN通过抑制ALOX5/NF-κB信号通路抑制巨噬细胞糖酵解从而改善DN进展.

目的 基于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,探讨复方蜥蜴散调控糖酵解降低胃癌顺铂耐药性的效应机制.方法 体外培养人胃癌MKN45、MKN45/DDP(顺铂耐药)细胞,以不同质量浓度顺铂(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL)干预,检测其存活率、半数抑制浓度(IC50)和耐药指数.于裸鼠右前腋窝皮下接种MKN45/DDP细胞悬液制备胃癌耐药裸鼠移植瘤模型,将造模成功的裸鼠随机分为模型组、顺铂组(0.002 g/kg)、复方蜥蜴散组(2.8 g/kg)、联合组(剂量同各单药组),每组8只;各药物组裸鼠给予相应药液,每周2次(顺铂,腹腔注射)或每天2次(复方蜥蜴散,灌胃),连续4周.实验期间,监测各组裸鼠体重并计算其肿瘤体积和肿瘤生长抑制率,检测其肿瘤组织中炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6)水平,多药耐药相关蛋白1(MRP1)、P糖蛋白(P-gp)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)mRNA及蛋白,以及PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)蛋白的表达情况.结果 在不同质量浓度顺铂的干预下,耐药细胞MKN45/DDP的存活率均显著高于亲本细胞MKN45(P＜0.05);MKN45/DDP和MKN45细胞的IC50分别为(1.0520±0.2219)、(0.3721±0.2380)μg/mL,耐药指数为2.827.与模型组比较,顺铂组、复方蜥蜴散组、联合组裸鼠的肿瘤生长均受到不同程度的抑制,肿瘤生长抑制率显著升高(P＜0.05);肿瘤组织中炎症因子水平,MRP1、P-gp、GLUT1、LDHA mRNA及蛋白的表达(顺铂组除外),PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平(顺铂组除外),以及HK2、PKM2蛋白的表达均显著降低或下调,且联合组的效果显著优于顺铂组(P＜0.05).结论 复方蜥蜴散可通过减少肿瘤相关炎症因子的分泌,抑制糖酵解、耐药相关蛋白及基因的表达,抑制PI3K/Akt信号通路的活化来抑制胃癌耐药细胞移植瘤裸鼠的肿瘤生长,具有一定的顺铂增效及逆转耐药的作用.

糖酵解是原发性肝癌代谢重编程过程中重要的生物学事件,其机制主要受糖酵解途径中的关键限速酶,包括己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)所调节,并可通过葡萄糖转运体(glucose transporter,GLUT)、单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporter,MCT)、PI3K/AKT/mTORC 信号通路和缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)等多种环节机制进行调控.越来越多的研究证明,糖酵解关键酶及调节因子在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞增殖、侵袭、转移、免疫逃逸及耐药等方面发挥重要作用.当前随着对于糖酵解机制的深入研究,针对抑制糖酵解的临床治疗已成为新型治疗HCC策略的方法.本文旨在从糖酵解重要关键酶及调节因子参与原发性肝癌发生与发展的研究进展方面作一综述,以期为肝癌的预防和治疗提供一些新的帮助.

目的 探讨低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂对药物耐受人肺腺癌A549持留细胞(A549/DTPs)的影响及与糖酵解途径的关系.方法 ①用4μg/ml(IC50)顺铂处理A549细胞10 d,构建顺铂诱导的A549/DTPs模型;采用CCK-8法检测A549、A549/DTPs对顺铂的耐受情况.②采用CCK-8法检测丹参酮ⅡA、顺铂以及两药联用对A549/DTPs的细胞抑制率,筛选低毒剂量丹参酮ⅡA、顺铂以及两药联用对A549/DTPs作用的终浓度,并通过Isobologram分析两药联用的协同作用.③将A549/DTPs分为4组:对照组、顺铂组、低毒剂量丹参酮ⅡA组、低毒联合组(低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂组).采用CCK-8法检测细胞抑制率;ATP含量检测试剂盒检测ATP含量;qRT-PCR和Western blot法检测葡萄糖转运蛋白(GLUT4)、己糖激酶(HK2)、果糖磷酸激酶(PFKFP3)和丙酮酸激酶(PKM2)蛋白和mRNA的表达情况.结果 ①CCK-8结果显示:当顺铂浓度≥0.5μg/ml时,与A549细胞比较,A549/DTPs的细胞抑制率降低(P<0.05).②CCK-8结果显示:与单用顺铂比较,浓度≥0.1μg/ml顺铂联合低毒剂量丹参酮ⅡA后细胞抑制率升高(P<0.05).故选择0.1μg/ml顺铂联合20μg/ml(IC10)丹参酮ⅡA进行后续实验研究,Isobologram分析结果表明低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂对A549/DTPs有协同作用.③与对照组相比,低毒剂量丹参酮ⅡA组和顺铂组ATP含量、GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2的mRNA和蛋白水平差异均无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,低毒联合组ATP含量降低,GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2的mRNA和蛋白水平均下调(P<0.05);与低毒联合组相比,低毒剂量丹参酮ⅡA组和顺铂组细胞抑制率降低,ATP含量升高,GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2的mRNA和蛋白水平均上调(均P<0.05).结论 低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂抑制A549/DTPs形成,即抑制顺铂诱导的DTPs形成,可能与糖酵解途径有关.