目的:探究以成纤维细胞生长因子受体(FGFR)非对称二聚化模型为结构基础设计成纤维细胞生长因子19(FGF19)的非促肿瘤型改构体,并对其增殖活性和代谢活性进行评估,使其成为治疗胆汁淤积症的候选药物之一.方法:利用pymol软件分析蛋白晶体结构并设计FGF19改构体,将构建好的FGF19改构体(FGF19F159A)与FGF19野生型(FGF19WT)的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,经过诱导表达、变性、复性获得正确构象的蛋白,经过镍柱亲和层析与分子排阻色谱方法纯化得到目的蛋白;通过蛋白邻位连接技术(PLA)对比FGF19WT和FGF19F159A诱导受体二聚化的程度;MTT实验检测细胞增殖活性;Western blot实验检测磷酸化成纤维细胞生长因子受体底物2(P-FRS2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(P-ERK)、胆固醇7α-羟化酶(Cyp7Al)的蛋白表达水平;免疫组化法检测动物肝脏中促增殖指标Ki67和增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达水平;RT-qPCR法检测动物肝脏中肿瘤指标甲胎蛋白(AFP)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)、表皮生长因子受体(EGFR)的相对mRNA水平;质谱法测定肝脏中胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)的含量;以db/db小鼠为模型,连续给药1个月,监测药物的慢性降糖效果,糖耐量实验检测其对糖耐量的改善能力.结果:以蛋白结构为基础成功构建了 FGF19F159A,经过表达纯化得到了高纯度的目的蛋白;PLA结果显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A诱导受体二聚化的能力明显减弱(P＜0.01);MTT实验显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A的促增殖活性明显减弱(P＜0.05);Western blot实验表明,与FGF19WT组相比,FGF19F159A明显下调P-FRS2和P-ERK的蛋白表达水平(P＜0.05);免疫组化结果显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A组Ki67和PCNA的蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组AFP、CCNA2、EGFR的mRNA水平明显降低(P＜0.01);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组肝脏中Cyp7Al的蛋白表达水平,胆汁酸CA、DCA、UDCA、CDCA的含量差异无统计学意义(P＞0.05);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组的降糖能力和改善糖耐量的能力差异无统计学意义(P＞0.05).结论:基于FGFR非对称二聚化模型设计的FGF19改构体FGF19F159A能够在极大减弱细胞增殖活性的同时保留其代谢活性,有望成为治疗胆汁淤积症的候选药物.

研究表明,高血糖介导的"慢性微炎症"可以导致糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)患者出现"炎症性足细胞损伤".其中,"坏死性凋亡"是新的足细胞死亡形式,与肾脏纤维化密切相关.为了探究传统治肾中药黄蜀葵花的提取物——黄蜀葵花总黄酮(total flavones of Abelmoschus manihot,TFA)在体内改善DKD足细胞坏死性凋亡和肾脏纤维化的作用和机制,并进一步揭示其"多途径、多靶点"的科学内涵,笔者将全部大鼠随机分为4组,即正常组、模型组、TFA组以及雷帕霉素(rapamycin,RAP)组.在改良型DKD大鼠模型成功建立后,每天经灌胃分别给予4组大鼠双蒸水、TFA混悬液以及RAP混悬液.在药物干预的第4周末,处死全部大鼠,收集尿液、血液以及肾组织等标本,进而针对模型鼠足细胞坏死性凋亡和肾脏纤维化各项指标进行观察、检测和分析.结果显示,对于改良型DKD模型鼠,TFA和RAP改善了一般情况、体质量、血清肌酐、尿白蛋白以及肾脏肥大指数;改善了肾脏纤维化指标,包括肾小球组织形态特征、肾小球内纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,collagen Ⅰ)染色程度以及肾组织FN、collagen Ⅰ、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和Smad2/3蛋白表达水平;改善了足细胞损伤,包括足突形态以及肾组织中podocin、CD2AP蛋白表达水平;改善了肾脏中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)介导的足细胞坏死性凋亡,包括足细胞坏死性凋亡形态特征以及肾组织中TNF-α、磷酸化底物混合谱系激酶样蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain like pseudokinase,p-MLKL)表达程度和蛋白表达水平,其中,对于p-MLKL,RAP的作用更强;改善了肾脏中受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting serine/threonine protein kinase,RIPK)1/RIPK3/MLKL信号轴活性,包括其关键信号分子蛋白表达水平,如磷酸化受体相互作用蛋白激酶(phosphorylated receptor interacting serine/threonine protein kinase,p-RIPK)1、p-RIPK3、p-MLKL和半胱氨酸蛋白水解酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8,caspase-8),其中,对于p-RIPK1,TFA的作用更强.总之,该研究阐明:TFA通过抑制TNF-α介导的RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴活性而减轻DKD足细胞坏死性凋亡和肾脏纤维化.笔者的发现为深入揭示TFA治疗DKD肾脏纤维化的科学内涵提供了新的药理学证据.

目的 探索成纤维生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)在调控内皮稳态时对上游分子N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline、AcSDKP)的影响和下游微小RNA let-7(microRNA let-7、miR let-7)的诱导作用及与内皮细胞线粒体生源的关系,以期最终研究FGFR1在内皮稳态中的调控作用.方法 下调FGF/FGFR1信号通路,蛋白质印迹(Western印迹,WB)法和细胞免疫荧光(Immunofluorescence staining)技术检测线粒体融合蛋白MFN2(mitofusin-2)、OPA1(optic atrophy protein 1)和分裂蛋白DRP1(dynamin-related protein-1)的表达;应用线粒体染色(MitoTraker Green)检测线粒体的生成;运用实时荧光定量核酸扩增(Real-time Quantitative PCR、qPCR)检测技术检测microRNA let-7的表达.结果 FGFR1通过诱导microRNA let-7b-5p的生成促进AcSDKP维持线粒体的生源;AcSDKP修复细胞因子复合物Triple(TGF-β2、IL-1β和TNF-α)所引起microRNA let-7b-5p表达抑制与线粒体的生成密切相关;抑制microRNA let-7b-5p的表达后,AcSDKP失去促进线粒体生成的作用;上调microRNA let-7b-5p的表达后,可修复内皮细胞中因FGF/FGFR1底物FRS2(fibroblast growth factor receptor substrate)沉默所致通路缺失所致的线粒体生成障碍.结论 FGFR1通过上调microRNA let-7b-5p的表达,促进线粒体的生成,从而在内皮细胞的稳态中起着十分重要的作用.

目的 探讨肾母细胞瘤组织中miR-613表达水平及其抑制肾母细胞瘤细胞增殖的作用机制.方法 收集64例肾母细胞瘤患者术后肾母细胞瘤组织及癌旁组织标本,用PCR检测组织中miR-613表达量.在SK-NEP-1和G401肾母细胞瘤细胞中转染miR-613模拟物,用Real-time PCR检测miR-613表达量.用MTT法检测miR-613对肾母细胞瘤细胞增殖的影响.用流式细胞仪检测miR-613对肾母细胞瘤细胞凋亡的影响.用生信分析及双荧光素酶报告基因预测及验证miR-613和FRS2的靶向关系.用Real-time PCR和Western blot法检测FRS2基因的mRNA及蛋白表达的影响.结果 肾母细胞瘤组织中miR-613表达量显著低于癌旁组织(P＜0.05).miR-613表达量与肾母细胞瘤患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移和病理学分型无关(P＞0.05),与肿瘤临床病理分期相关(P＜0.05).转染miR-613 mimics组肾母细胞瘤细胞中miR-613表达量显著高于空白组和miR-NC组(P＜0.05).在肾母细胞瘤细胞中,过表达miR-613能显著抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P均＜0.05).双荧光素酶报告基因证实FRS2是miR 613的靶基因,在肾母细胞瘤细胞中,过表达miR 613可抑制FRS2基因mRNA及蛋白表达量.结论 miR-613是肾母细胞瘤发生中的抑癌因子,可能是通过靶向下调FRS2基因水平从而抑制肾母细胞瘤细胞的增殖.

目的 探索成纤维生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)调控血管内皮细胞内皮-间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)影响肾小管上皮细胞上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的作用,以期为糖尿病肾纤维化血管内皮的功能研究提供新的靶点.方法 成纤维生长因子受体底物2(FRS2)siRNA(FRS2siRNA)下调人皮肤微血管内皮细胞(HMVECs)FGF/FGFR1信号通路导致EndMT发生,转移该培养基培养HK2上皮细胞后,用Western印迹法和细胞免疫荧光(immunofluorescence staining)技术检测内皮细胞EndMT、EMT标志物及转化生长因子β(transforming growth factor,TGFβ)信号通路靶点的表达情况.结果 FGFR1缺陷后,可引起内皮细胞TGFβ信号通路上调,从而导致HMVECs的EndMT;HMVECs发生EndMT后的培养基可以诱导HK2的EMT标志物表达增加、TGFβ信号通路激活.结论 内皮FGFR1缺陷诱导的EndMT依赖于TGFβ信号转导诱导相邻上皮细胞中发生EMT;内皮细胞FGFR1是维持内皮稳态和上皮稳态的重要分子,是抗糖尿病肾纤维化的关键靶点.

胰岛素样生长因子-1 ( insulin-like growth factor-1,IGF-1)也称为生长抑素C,是一种主要由生长激素刺激肝脏产生的一种调节机体新陈代谢及细胞增殖、分化、迁移的重要物质.与生长激素及下丘脑释放的促生长激素释放激素形成反馈调节通路.IGF-1的本质是一种70 kDa的多肽,由12号染色体上的基因调控,IGF-1信号通路包括配体、受体及6种结合蛋白( IGFBP1-6 ) , IGF-1 主要与受体 IGF-1 R 结合,而结合蛋白起着延长IGF-1 半衰期及携带转运IGF-1的作用,其中最常见的结合蛋白为 IGFBP3.目前IGF-1被广泛认可的调控机制为:IGF-1与IGF-1R结合后激活胰岛素受体底物IRS及SHC,IRS1/IRS2进一步激活PI3k-Akt-mToR信号通路,SHC可激活RAS/RAI和EPK/MAPK通路[1] ,从而进一步调节机体的物质代谢及细胞增殖、凋亡及迁移.胰岛素样生长因子在全身广泛分布,在肺组织中也有广泛表达(包括气道上皮细胞、肺实质细胞、平滑肌细胞、肺成 纤维细胞及肺泡巨噬细胞等).目前已有大量研究证明IGF-1 与肺部疾病(肺癌、肺纤维化、急性肺损伤、支气管肺发育不良、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、呼吸睡眠暂停综合征等)存在关联,但在不同疾病中, IGF-1 起到的作用及相应的变化不同,在这篇文章中,我们将对IGF-1在肺部疾病发生发展中的作用进行综述,以期对IGF-1 与肺部疾病的关系有一个系统全面认知.

[目的]探讨miR-145体内转染对骨性关节炎模型小鼠关节软骨的影响.[方法]8周龄雄性C57小鼠40只,随机分为4组,每组10只.分别为正常对照组(normal control,NC)、骨性关节炎模型组(osteoarthritis model,OAM)、正常动物转染组(transferred normal animal,TNA)及OA模型转染组(transferred OAM,TOAM).对OAM和TOAM组动物切断全部内侧半月板-胫骨韧带建立OA模型.7、10 d时,对TOAM组和TNA组关节腔内注射载有miR-145的腺病毒液20μl.再过4 d后过度麻醉处死动物.行大体和组织学观察,并采用qPCR和Western blot检测相应标志物.[结果]形态方面,与NC组相比,OAM组关节软骨结构明显紊乱,纤维细胞增生,基质着色主要呈现蓝绿色.TNA组的软骨结构完整,但陷窝中出现空泡,基质着色呈蓝绿色.相比之下,TOAM组软骨结构完整,关节软骨基质着色呈红色,与NC组接近.免疫组化检测显示,与NC组相比,OAM组和TNA组的FRS2、LC3和p62染色的OD值均显著增加(P＜0.05);而TOAM组的FRS2、LC3和p62染色的OD值显著低于OAM组和TNA组(P＞0.05).定量检测方面,与NC组相比,OAM组的miRNA-145的mRNA表达水平显著下降(P＜0.05),而体内转染后,TNA组和TOAM组的miRNA-145的mRNA表达水平显著高于NC组(P＜0.05).OAM组的LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低且p62表达水平显著升高(P＜0.05).TOAM组的p62的表达水平显著低于OAM组和TNA组(P＜0.05).[结论]miR-145体内转染可减轻关节失稳状的软骨退变,其机理可能与改变软骨自噬功能有关.

目的 探讨天麻素(GSTD)对高脂和高胆固醇(HFHC)饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗作用及可能机制.方法 6周龄雄性C57BL/6小鼠按体重分为6组,每组8只:正常对照组、模型组、模型+GSTD 12.5,25.0和50.0 mg·kg-1组及模型+二甲双胍(Met)100 mg·kg-1阳性对照组.除正常对照组外,其余各组小鼠饲喂HFHC饮食24周建立NASH模型;第17周开始,治疗组同时ig给予相应分组药物,每天1次,连续8周.第24周末,测量小鼠肝湿重、体重和肝指数.HE染色观察肝组织形态,计算非酒精性脂肪性肝病活动积分(NAS),Masson染色观察肝组织胶原纤维增生,油红O染色观察肝组织脂质沉积,血糖仪测全血血糖,ELISA法检测血清胰岛素水平计算胰岛素抵抗指数;化学显色法检测血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性,肝组织中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(NEFA)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性;实时定量PCR(RT-qPCR)检测肝组织脂质合成基因〔脂肪酸合成酶(FASN)、血小板反应蛋白受体(CD36)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、过氧化物酶增殖物活化受体γ(PPARγ)〕脂质氧化基因PPARα、肉毒碱棕榈酰基转移酶1α(CPT1-α)、炎症因子基因〔肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、趋化因子配体2(CCL2)和CCL5〕和纤维化标志物基因〔Ⅰ型胶原α1(ColⅠα1)、肌动蛋白α2(Actα2)、结缔组织生长因子(CTGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)〕mRNA水平;Western印迹法检测肝组织胰岛素受体底物1(IRS-1)、蛋白激酶B(Akt)和NF-κB蛋白磷酸化水平.结果 与正常对照组相比,模型组肝湿重和体重增加(P<0.01),肝指数升高(P<0.05);肝组织出现严重的大泡性脂肪变性,并伴有大量炎症细胞浸润和胶原纤维增生,NAS评分升高(P<0.01);血糖和血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数以及血清GPT和GOT活性升高(P<0.01);肝组织TG、TC、NEFA和MDA水平升高(P<0.01),GSH水平、SOD和CAT活性降低(P<0.01);脂质合成基因mRNA水平升高(P<0.01),脂质氧化基因mRNA水平降低(P<0.01);炎症因子和纤维化基因mRNA水平升高(P<0.01);肝组织IRS-1和Akt蛋白磷酸化水平降低(P<0.01),NF-κB蛋白磷酸化水平升高(P<0.01).与模型组相比,模型+GSTD 50.0 mg·kg-1组肝湿重、体重和肝指数降低(P<0.05,P<0.01).模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1组肝组织大泡性脂肪变性减少,NAS评分显著降低(P<0.05,P<0.01),炎症细胞浸润和胶原纤维增生减少,同时,血糖和血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数以及血清GPT和GOT活性降低(P<0.05,P<0.01);此外,模型+GSTD 50.0 mg·kg-1组肝组织中TG、TC、NEFA和MDA水平降低(P<0.01),GSH水平、SOD和CAT活性升高(P<0.01),脂质合成基因mRNA水平降低(P<0.01),脂质氧化基因mRNA水平增加(P<0.01);模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1组肝组织中炎症因子和纤维化基因mRNA水平均显著下降(P<0.05,P<0.01);模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1组肝组织IRS-1和Akt蛋白磷酸化水平升高(P<0.01),NF-κB蛋白磷酸化水平降低(P<0.01).结论 GSTD对HFHC饮食诱导的小鼠NASH具有显著的治疗作用,其作用机制可能与激活肝内IRS-1/Akt信号通路,缓解氧化应激和抑制NF-κB信号介导的炎症反应有关.