建立一种基于荧光定量PCR的扩增阻滞突变系统方法（amplification-refractory mutation system quantitative real-time PCR，ARMS-qPCR）检测 SLC25A13基因c.2T>C突变并验证其诊断性能。根据ARMS-qPCR引物设计原则，针对 SLC25A13的保守序列设计特异性引物，利用人工合成纯合突变型质粒及200份已测序验证的人外周血核酸样本建立 SLC25A13基因c.2T>C突变ARMS-qPCR检测体系及其Sanger测序体系，并应用提取自另外其他200份人外周血的核酸样本验证此体系的诊断效能，所获结果与作为金标准的Sanger测序结果对比，分析2种检测方法的一致性。结果显示，本研究建立的ARMS-qPCR体系可准确区分 SLC25A13基因野生型及携带c.2T>C突变型；利用该方法检测人外周血中 SLC25A13 c.2T>C突变状态，其检测结果与Sanger测序结果一致性为100%。200份外周血样本中，携带 SLC25A13基因c.2T>C突变8份（4%），非携带者192份（96%）。综上，本研究建立的ARMS-qPCR测试能够快速、准确地检测 SLC25A13基因c.2T>C突变，有助于希特林蛋白缺陷病（citrin deficiency，CD）的诊断。

目的:研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing，QS)系统核心调控子OpaR对 pilABCD的转录。 方法:提取副溶血弧菌野生株(wild-type，WT)和 opaR突变株(Δ opaR)的总RNA，采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)研究OpaR对 pilA( pilABCD首基因)的转录调控；将 pilABCD上游调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游，构建LacZ重组质粒，并将该重组质粒转入WT和Δ opaR中制备LacZ菌株，通过LacZ报告基因融合试验研究OpaR对 pilA的调控以及 pilA的时相表达。提取WT株总RNA，采用引物延伸试验研究 pilABCD的转录起始位点；PCR扩增 pilABCD上游调控区DNA序列，并纯化His-OpaR蛋白，通过凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)研究His-OpaR与靶DNA片段是否有直接的结合作用，并进一步采用DNaseⅠ足迹试验分析其结合位点。 结果:qPCR和LacZ报告基因融合试验显示OpaR对 pilABCD的转录具有激活作用， pilA的表达水平随培养时间的延长而持续升高；引物延伸结果显示 pilABCD只有一个转录起始位点T(-155)；EMSA和DNaseⅠ足迹试验结果显示OpaR对位于 pilA的翻译起始位点上游-246~-197 bp和-181~-131 bp之间的DNA序列具有结合活性。 结论:OpaR对 pilABCD的转录具有直接的激活活性。

[目的]研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对calR基因以及CalR对Ⅵ型分泌系统l(type VI secretion system 1,T6SS1;vp1386-1420)相关基因的转录调控关系.[方法]提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株的总RNA,采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)研究调控子对靶基因的转录调控关系;采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断调控子对靶基因的调控关系;将靶基因的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和调控子基因突变株中,获得LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验进一步研究调控子对靶基因的调控关系.PCR扩增靶基因的上游调控区DNA序列,并纯化His-重组调控子蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究His-重组蛋白对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用,若有结合作用,则进一步采用DNase I足迹实验研究具体的结合位点.[结果]在细菌生长密度(OD600)从 0.05依次增加到1.20时,CalR的表达水平呈梯度升高特征;QS系统在低细胞密度下的核心调控子AphA对calR基因的转录没有调控作用,而高细胞密度下的核心调控子OpaR对calR基因的转录具有间接的激活作用.此外,在非诱导条件下,CalR直接结合到vp1388-1390、vp1393-1406、vp1400-1406和vp1409-1407启动子区DNA序列上促进它们的转录.[结论]OpaR间接激活CalR的表达,而CalR是非诱导条件下维持T6SS1基础表达所必需的调控子.

[目的]探究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对mshH基因的转录调控.[方法]提取特定条件下副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株(△aphA 和 △opaR)的总 RNA,采用实时定量 PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究AphA和OpaR对mshH基因的转录调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;将mshH启动子区DNA序列克隆入pHRP309质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,并将其转入WT、△aphA和△opaR中,获得LacZ实验菌株,再通过LacZ报告基因融合实验研究AphA和OpaR对mshH基因的调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;PCR扩增mshH上游启动子区DNA序列,并纯化His-AphA和His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMS A)和DNase I足迹实验,研究体外条件下His-AphA和His-OpaR对靶基因启动子区DNA片段是否具有直接的结合作用以及具体的结合位点.[结果]mshH基因的表达水平随着培养时间的延长而升高;低细菌密度时,AphA抑制mshH基因的转录,但His-AphA对mmshH启动子区DNA序列没有结合活性;高细菌密度时,OpaR对mshH基因的转录具有激活作用,His-OpaR对位于mshH基因的翻译起始位点上游-160至-80 bp和-58至-19 bp之间的DNA序列具有结合活性.[结论]低细菌密度时,AphA可能是通过间接方式抑制mshH基因的转录;高细菌密度时,OpaR直接结合到mshH调控区DNA片段上,并激活其转录.