本研究对来源于苦荞的α-螺旋发夹抗菌肽FtAMP抗真菌机制与结构之间的关系进行了研究.首先人工合成了FtAMP分子中N-端和C-端的α-螺旋(FtAMP-N和FtAMP-C),探究两个α-螺旋究竟是哪个螺旋在起抗菌作用.然后以FtAMP为模板,α-螺旋区电荷和两亲性特征为变化要素,利用螺旋轮投影和特定氨基酸残基替换的方法,对其进行初步分子改造,并通过对多肽结构和活性比较,探讨FtAMP结构-功能的关系.研究表明,FtAMP-N和FtAMP-C都显示出良好的抗菌活性.根据螺旋轮投影方法分析螺旋的两亲性特征,并以FtAMP氨基酸序列为模板,分别表达4个FtAMP突变体(FtAMP-E12A、FtAMP-E12A/E9K、FtAMP-E12A/E9A和FtAMP-E12A/E9K/T24E).圆二色光谱分析显示,4个多肽都可正确折叠成α-螺旋结构,在208 nm和222 nm处有典型的双负峰,表明氨基酸的改变及其表达过程中并未改变多肽的二级结构.抗真菌活性分析显示,与FtAMP相比,4种突变体对植物真菌的抑制作用均有一定增强.特别是FtAMP-E12A/E9K突变体,其抗真菌作用增强约1倍,同时诱导溶血活性并不显著,选择特异性提高近2倍.该研究也进一步表明,α-螺旋发夹抗菌肽发挥抗真菌效应主要与其螺旋结构有关,而与其抑制剂的活性位点没有关系,为该类抗菌肽结构和功能的关系提供了一定的参考.

羊毛硫细菌素是由细菌核糖体上合成并经翻译后加工修饰而成的一类抗菌肽.已经在多种G+细菌中发现有羊毛硫细菌素,大多对G+细菌有抑菌作用.羊毛硫细菌素的基因工程无法从单一的表达羊毛硫细菌素结构基因获得高活性的成熟羊毛硫细菌素.本研究综述了羊毛硫细菌素前体分子定向位点突变后,由修饰酶重新识别和修饰可产生结构变异的可分泌的变体分子和无法分泌的变体分子,对羊毛硫细菌素分子突变位点进行了分类和归纳,并总结了羊毛硫细菌素分子突变位点与其生物活性的关系.在现有羊毛硫细菌素应用成果有限的条件下,对于工程改造羊毛硫细菌素和增强其抑菌活性具有重要意义.

目的 构建抗变异链球菌的低毒、高活性、快速的新型抗菌肽,并探讨其在防治龋病方面的潜能.方法 根据两亲性正电性α-螺旋结构抗菌肽的设计理念,对乳酸杆菌拮抗变异链球菌的代谢产物reuterin 6和/或gassericin A进行活性改造,分别通过细菌敏感性实验、细胞毒性实验和杀菌-时效实验来评估衍生肽的抗菌效果和生物相容性,再进一步检测目标抗菌肽抗变异链球菌的速率、抗多种口腔致病菌的活性和发展耐药菌株的能力.结果 构建了6条AT-1衍生肽,并从中筛选出了低毒、高活性、快速的新型抗菌肽AT-7;具有高疏水性、不完美两亲性的AT-7抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和黏性放线菌等口腔致病菌的最小抑菌浓度是3.3μmol/L,在5 min内即可抑制88.7％的变异链球菌,以及连续诱导10代的处理仍不能产生耐AT-7的变异链球菌.结论 疏水性和不完美两亲性都是决定抗菌肽的抗菌效果的重要因素;抗菌肽AT-7具有转化为口腔临床用药的潜力.

[目的]对抗菌肽Cec4进行结构改造,并评估优化小肽的稳定性及溶血性.[方法]采用序列截短、氨基酸替换的方式来改造Cec4.采用微量稀释法,检测改造后的Cec4对各类鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC).绘制时间-杀菌曲线,并评估不同因素对抗菌肽抑菌活性的影响,最后通过溶血实验检测其安全性.[结果]①截短后的Cec4失去抑菌效果.②Cec4氨基酸替换后的Cec4-1、Cec4-2未能提升抑菌能力.Cec4-4的MIC值为Cec4的50％.③在24h,时间-杀菌曲线显示,Cec4-4的抑菌活性较Cec4高30％.④血清会影响抗菌肽活性,并且高浓度胰蛋白酶(1.0 mg/mL)会抑制Cec4-4抗菌活性.⑤溶血实验表明Cec4-4在1 mg/mL浓度下无溶血反应.[结论]截短使Cec4失去抑菌活性,氨基酸替换后的Cec4-4对各测试菌的抑菌活性较母肽提升了1倍,且抗菌肽在1mg/mL浓度下对人体无溶血反应.

目的:对溶血性较高的天然抗菌肽Temporin-1Dra进行氨基酸替换,以期获得低毒性、对白色念珠耐药菌株具有抑菌活性的抗菌肽.方法:采用生物信息学相关软件对改造之后的天然抗菌肽Temporin-1Dra进行分析,主要包括抗菌肽形成概率、理化性质、二级结构的预测;测定合成多肽的最低抑菌浓度,杀菌曲线,部分抑菌浓度指数(FIC index).结果:对天然抗菌肽进行生物信息学分析改造得到多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra,对耐氟康唑(FLC)白色念珠菌的MIC值为128μg·mL-1;MIC范围内溶血率<5％;3 h内MIC浓度下杀菌效率显著,且呈现浓度依赖性;与FLC联用的FIC index为0.375,与FLC联合用药有协同作用.结论:改造之后的抗菌肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra(HFLKKLVKLAKKIL-NH2)对白色念珠菌耐药菌株具有抑制作用,体外溶血性低、杀菌效果显著.

为获得分子量小、毒性低的抗感染多肽药物先导分子,以来源于青环海蛇的cathelicidin家族抗菌肽Hc-CATH为模板,设计了长度分别为16和15个氨基酸残基的改造体Hc-16和Hc-15,并通过CCK8实验、最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)实验、ELISA 实验和生物膜干涉技术(Bio-layer interferometry,BLI),对其进行毒性、抗菌活性、抗炎活性及LPS中和活性筛选.结果显示,两种改造体中,Hc-16对包括临床耐药菌在内的病原体具有广谱抗菌活性,最小抑菌浓度仅为4.69 μg/mL.同时抑制了 LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-6的表达,显著降低感染诱发的炎症反应及细胞毒性.此外,构效关系研究表明C-、N-两端的苯丙氨酸在Hc-16抗菌抗炎活性中起着至关重要的作用.综上,Hc-16改造肽相比原模板具有更高的抗菌抗炎活性、更低的毒性以及更小的分子量,因而具有成本低、更好的成药性优势和较好的临床应用价值.

运用生物信息学方法进行东北林蛙抗菌肽dybowskin-1 ST的进化、结构及抗原表位预测,分析其抑菌机理及结构性质,应用小鼠伤口愈合实验及体外抑菌实验进行活性验证.同时为改良亲本肽、进行新型衍生肽的研发提供理论基础.使用软件MEGA X对dybowskin-1 ST及其他蛙类抗菌肽进行同源性比对并绘制系统进化树;通过在线软件ProtParam、 ProtScale、PeptideCutter、SignalP、TMHMM Server分别预测抗菌肽dybowskin-1 ST的理化参数、亲/疏水性、剪切位点、信号肽及跨膜区域;分别应用SOPMA、Jpred4及DNAstar Protean软件多重分析预测dybowskin-1 ST的二级结构,利用SWISS-MODEL和I-TASSER软件进行三级结构预测.通过在线软件ABCpred和SYFPEITHI进行T/B抗原表位预测.构建小鼠伤口模型,观察dybowskin-1 ST促进伤口愈合活性.应用纸片法及96孔板法,确定dybowskin-1 ST的抑菌活性.抗菌肽dybowskin-1 ST含有59个氨基酸,其中亮氨酸占16.9％,分子式为C318Hs10N80O93S2,理论等电点为5.10,电荷量为-2.抗菌肽dybowskin-1 ST与东北林蛙抗菌肽dybowskin-1CDYa亲缘较近.三种方法二级结构预测结果相似,dybowskin-1 ST中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲,所占比例分别为44.07％、16.95％、3.39％、35.39％.三级结构预测中显示该抗菌肽大部分为α-螺旋结构,抗菌肽dybowskin-1 ST总体预测为亲水性蛋白,具有信号肽序列.亚细胞定位分析显示,其分泌线粒体靶向肽的可能性为0.944.该蛋白属于膜外蛋白,无跨膜结构区,有7个磷酸化位点,3个T细胞抗原表位和8个B细胞抗原表位.dybowskin-1ST具有促进伤口愈合的作用,能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性,但对真菌及耐药菌的抑菌活性有限.dybowskin-1 ST结构中虽富含α-螺旋,但验证实验表明其抑菌能力仍有待加强,原因可能是由于其带负电荷且为亲水性蛋白,以提高正电荷数及改变疏水性为基本思路进行氨基酸改造可获得活性升级的衍生肽.

目的 对斑马鱼Hepcidin-2基因结构进行生物信息学分析,并设计优化其抗菌活性.方法 选取斑马鱼Hepcidin-2作为目的基因,通过Tblastn进行多序列同源性比对得到Hepcidin基因家族的核苷酸和氨基酸序列,利用生物信息学方法分析其进化关系、理化性质、信号肽、跨膜结构、二级结构、三级结构等;收集和筛选多个物种的Hepcidin序列152条,计算成熟肽各个位置最大频率的氨基酸,得到序列模板,并对序列模板进行预测.结果 抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)活性中心空间结构高度保守,C-末端及信号肽区域形成跨膜螺旋结构,成熟肽部分存在β-折叠,得到的序列模板预测具有抗真菌活性,对肺炎克雷伯菌有抗菌活性,对人红细胞有溶血活性.结论 建立了序列模板法优化AMP序列和预测其抗菌活性的技术路线,为改造天然AMP,扩大其在临床和生产中的应用提供了理论支持和技术支撑.

抗生素滥用加速了细菌产生抗生素耐药性,抗菌肽作为对抗抗生素耐药细菌的潜在候选药物备受关注.buforinⅡ作为其中一种潜力分子成为目前的研究热点.buforinⅡ的结构类似于阳离子α螺旋抗菌肽,其"螺旋-脯氨酸铰链-双亲性螺旋"的独特结构在抗菌和抗癌等方面起决定性作用.通过截短、替换和拼接等策略对buforinⅡ及其同源肽进行结构改造可获得具有良好抗菌和抗癌作用的衍生肽.同时,对不同物种间buforinⅡ同源肽的对比和分析拓宽了分子改造的思路.本文综述buforinⅡ及其重要衍生肽的结构及其抗菌和抗癌活性等的最新研究进展,为新抗菌肽的挖掘和临床应用提供理论依据.

抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的小分子肽,参与构成生物体先天免疫,可以有效抵抗病原微生物的入侵.抗菌肽具有广谱抗菌活性,且不易产生耐药性等特点,在治疗感染性疾病方面具有独特的优势,有望成为理想的抗感染药物.然而,由于部分抗菌肽尚存在稳定性差、毒性高等问题,限制了抗菌肽的广泛应用.由于人工智能算法能有效合成具有高稳定性、低毒性的抗菌肽,在探索天然抗菌肽中展现了巨大的潜力,因此本文简述了抗菌肽的抗菌机制、结构改造以及利用机器学习和深度学习等人工智能算法进行新型抗菌肽研发的优化策略,以期为抗菌肽结构优化及研发提供新思路.