目的 克隆获得水蛭Hirudo nipponia 弹性蛋白酶抑制剂(guamerin)基因HnGUA,并对其进行生物信息学分析、蛋白原核表达、时空表达模式等研究,以期为揭示水蛭抗凝类小分子物质生物合成途径、分子调控机理机制奠定基础.方法 以日本医蛭为研究对象,基于前期转录组数据,采用cDNA末端快速扩增方法(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获取HnGUA基因全长,并进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET32a-HnGUA,并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,诱导重组蛋白的表达;通过实时荧光定量检测了水蛭不同吸食阶段4个组织的HnGUA基因表达模式.结果 HnGUA基因cDNA全长507 bp(GenBank登录号OP490295),开放阅读框(Open reading frame,ORF)231 bp,编码76个氨基酸,蛋白分子量和理论等电点分别为8.17 kDa和4.44,包含一段长19个氨基酸的信号肽序列.多重比对分析结果显示,HnGUA蛋白与其他蛭类抑制剂基因编码蛋白具有较高的同源性.原核表达分析结果显示,构建的pET32a-HnGUA载体能在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,SDS-PAGE结果显示,诱导的重组表达蛋白相对分子质量在6 kDa左右,与预测大小一致.实时荧光定量PCR结果表明,HnGUA基因存在时空表达差异,其主要在皮肤和嗉囊组织中表达.结论 该研究首次在日本医蛭中克隆得到HnGUA基因,使其重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,并且进一步研究了该基因的时空表达模式,为后续深入研究该基因功能奠定基础,同时对于不依赖于水蛭药材直接生产活性成分,加快实现中药现代化进程具有重要的理论和实践意义.

目的:建立日本医蛭(水蛭)冻干粉(简称"冻干粉")的质量标准,为控制其质量提供参考.方法:取3批冻干粉,按照2015年版《中国药典》(一部)(简称"药典")水蛭项下要求对冻干粉进行鉴别、检查和抗凝血霉素活性分析;通过最大耐受量(MTD)实验来考察其毒性;通过设计温度、湿度和强光照射试验来考察其稳定性.结果:供试品薄层色谱中,在与对照药材色谱的相应位置显相同的紫红色斑点,紫外光灯(365 nm波长)下显相同的橙红色荧光斑点.3批样品的平均水分含量为2.61%、总灰分含量为2.83%、酸不溶性灰分含量为0.38%、pH为6.92、黄曲霉毒素总量为0.28μg/kg、抗凝血酶活性为257.0 U/g,除汞元素含量略高于药典水蛭项下限量外,铅、镉、砷、铜元素含量均符合药典规定.MTD实验结果显示,给予以生药量计26.4 g/kg的冻干粉后小鼠未出现死亡及不良反应,此剂量为药典规定最大用量的58倍.在20、40℃和强光[(4500±500)Lx]照射条件下,冻干粉的抗凝血酶活性随着贮藏时间的延长均明显下降,在4℃条件下保存6个月其抗凝血酶活性仍符合药典要求;在高湿(相对湿度为90%、75%)条件下,冻干粉的吸湿性极强.结论:本研究按照药典标准对日本水蛭冻干粉建立了一套系统的质量评价标准,可用于其质量控制.

目的 对蛭类转录组进行SSR分析,是开发功能分子标记、开展对药用蛭类资源的开发利用及进行遗传背景监测的必要手段.方法 利用与医学密切相关的医蛭科棒纹牛蛭Poecilobdella javanica和日本医蛭Hirudo nipponia、黄蛭科宽体金线蛭Whitmania pigra和山蛭科洞穴山蛭Heamadipsa cavatuses sp.nov.共14个样本,通过RNA测序及转录组分析,筛选吸血差异unigene,并比较4个种的SSR标记特征和分布,用于挖掘抗凝血相关功能EST-SSR.结果 通过SSR密度分析发现,SSR在棒纹牛蛭、日本医蛭、宽体金线蛭和洞穴山蛭转录组中的间隔长度为4 723、6 026、8 059、8 144 bp;SSR组成分析发现三碱基重复的基序占蛭类SSR类型组成中绝大多数;另外,洞穴山蛭的SSR组成与其他3种存在明显区别.比较4种吸血蛭吸血前后转录组中表达丰度显著差异的unigene群,发现4种蛭中包含SSR且抗凝血相关的重叠unigene类群在转录组中呈较高的片段多态性.结论 unigene片段长度、SSR的密度、组成和分布特点能反映物种之间的分类关系;4种蛭重叠的抗凝血相关分子功能对应的EST-SSR,可作为抗凝血相关的功能分子标记侯选EST-SSR.

为了研究饥饿及恢复喂食对日本医蛭肠道微生物菌群的影响,采用高通量测序技术分析了正常组、饥饿30d、恢复喂食7d以及恢复喂食14d的日本医蛭肠道微生物菌群特征及多样性的变化.结果显示:日本医蛭核心菌群门水平上,主要集中于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes),属水平核心菌群有气单胞菌属(Aeromonas)、Mucinivorans属、拟杆菌属(Bacteroides)、丹毒丝菌属(Erysi-pelothrix)等.饥饿及恢复摄食,对气单胞菌属、Mucinivorans属在内的核心菌群多样性及丰度产生了一定的影响.本研究为揭示日本医蛭肠道菌群组成以及研究日本医蛭消化道微生物功能奠定了基础.

目的:建立Native-PAGE结合Western blot检测水蛭活性多肽与凝血酶相互作用产物的方法,探究水蛭有效抗凝成分.方法:本研究分别提取宽体金线蛭、日本医蛭两种水蛭虫体总蛋白及日本医蛭唾液蛋白,用凝血酶滴定法测定其抗凝血酶活性,Western blot检测凝血酶-活性多肽复合体.结果:研究发现两种水蛭Native-PAGE-WB均检测到凝血酶-活性多肽复合体,且SDS-PAGE-WB检测到复合体变性后产生凝血酶条带.结论:建立的Native-PAGE-WB法可有效检出水蛭活性多肽和凝血酶相互作用产物,且发现同水蛭素类似,宽体金线蛭活性抗凝多肽与凝血酶在体外也能形成稳定的蛋白复合体.

人体寄生虫之种类繁多，分布甚广，其寄生于宿主体内之内寄生虫（Endoparasite）可别为原虫（Protozoa）与蠕虫（Heminth）两大类。蠕虫类又可分为扁虫及圆虫两门。属于此二门中之寄生虫，在临床上占重要地位，尤以吾国为然。在扁虫门中，可为我国寄生虫病原者（1），有日本血吸虫，姜片虫，中华肝蛭，肺蛭，裂头绦虫，绦虫，短小绦虫（短小包膜虫）等数种。在圆虫门中，可为我国人体寄生虫病原者（2），仅线虫纲中之鞭虫，蛔虫，蛲虫，肠圆虫，钩虫，毛线虫，眼线虫及丝状虫等数种。其中除丝状虫，眼丝虫及肺蛭（肺蛭之虫卵在痰中，其在粪便内者较罕）等外，普通均可在粪便中检到虫卵，是以凡欲窥知吾国某地一般肠蠕虫病流行之实际情形，乃于其粪便中检到虫卵最为确实。作者等最近两三年来，在常熟遇到蠕虫病例甚多，其中蛔虫病，姜片虫病及钩虫病例尤为习见。迩来日本血吸虫病在常熟流行之猖獗，亦堪为吾医务工作者所注意。惜无确实之统计，爰于一九五○年夏，就常熟县立初中学生自愿送验者285名，施行粪便检查，藉此略可窥见近年来吾国人体大部份肠虫病在常熟分布之一角也。同时使已感染肠虫病之同学，不特由是可以获得诊断与适当之治疗，并对若干种寄生虫病有多少认识。再由是推扩宣传，影响所及，在公共卫生上言，作用自必甚大，此系作者等对于此次检查工作中之又一目的也。

目的:通过特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)法结合微芯片电泳检测的方法,特异性鉴别宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3种水蛭品种.方法:针对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种的线粒体同源序列,设计区分正伪品水蛭以及分别鉴定3个品种水蛭样品的特异性引物;通过PCR和微芯片电泳检测的方法验证所设计引物的特异性;将验证得到的特异性引物进行整合,建立3个品种的特异性引物用于三重PCR的方法.结果:确定了用于区分宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种中正伪品的特异性引物KA;确定了宽体金线蛭特异性引物KT,日本医蛭特异性引物RI,菲牛蛭特异性引物FN;建立了3种特异性引物进行三重PCR鉴别3个品种水蛭药材的方法.结论:通过特异性引物结合三重PCR的方法,可以同步鉴定宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭的人为预混样品,鉴定结果准确,且用于三重PCR的特异性引物不存在引物之间相互结合或非特异性扩增的现象.

目的:研究日本医蛭的野外生境水域和生物学习性.方法:采用野外调查与室内养殖观察相结合的方法.结果:日本医蛭野外生存水域水质恶劣,达不到水产养殖常用Ⅲ类水标准,其主要污染源为氮(N)、磷(P)、化学需氧量(COD);休眠结束期在野外捕获的日本医蛭体重较轻,平均体重为0.114g,体重范围多分布在0.05～0.15g之间;其性成熟率随体重增加而增加,体重大于0.25 g时性成熟率为100％.日本医蛭生活史包括了休眠、产茧、孵化、生长等阶段,由于养殖地不同,各阶段在时间上存在较大差异.温度对日本医蛭的行为影响较大,16℃以下逐渐进入休眠,最佳的生长温度为28～32℃.结论:日本医蛭野外生境水质污染严重;其体重较轻;温度是影响日本医蛭生理状态的主要因素.

本文报道了对感染HBV阳性血液的38只日本医蛭（Hirudo nipponica Whitman）的体液HBsAg检出率和GMT（几何平均滴度）观察19周的结果。共检查13次，HBsAg的平均检出率为64.77%。GMT在1：28.21～1：64之间。检出结果表明在湖北，HBV至少可在蚂蝗体内存活19周。GMT在最初七周较高，此后逐渐降低，直至最低，后来又慢慢升高，推想是病毒在蚂蝗体内复制的表现。蚂蝗在吸血或转移吸血时，容易传播乙型肝炎，建议水田作业时，应防止蚂蝗叮咬。

目的 使用磁固相萃取、转录组文库及液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)鉴定技术,筛选和鉴定日本医蛭中的抗凝活性成分.方法 采用通用合成方法制备凝血酶固定化磁纳米粒,日本医蛭粗提液经磁固相萃取后,洗脱溶液使用高效液相串联三重四级杆飞行时间质谱联用(TripleTOF LC-MS/MS)技术并结合日本医蛭唾液腺转录组文库,进行抗凝多肽的筛选.结果 经傅立叶变换红外分光光度计及透射电镜表征,凝血酶成功固定于磁珠上,凝血酶磁珠的酶活性稳定性良好(37℃,19 d,RSD为4.74％);洗脱液经扫描比对含有5种水蛭素变体,均为凝血酶抑制剂,洗脱液冻干粉抗凝活性为70 U·g-1.结论 将磁固相萃取、转录组文库以及LC-MS/MS技术相结合成功开发了一种能快速筛选和鉴定日本医蛭中抗凝多肽分子的方法,该方法方便易行,可为动物药活性成分发掘提供参考.