采用高效液相色谱法建立水蛭药材特征图谱并同时测定5种有效成分的含量,为不同基原水蛭及其混淆品的质量评价提供依据.采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)软件对特征图谱结果进行分析,结果显示,27批蚂蟥HPLC特征图谱具有8个共有峰,并通过对照品对比确认其中5个成分,分别为:尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、水蛭胺C羧基衍生物、水蛭胺B;采用SIMCA-P 14.0软件进行聚类及偏最小二乘法分析,均可将不同基原水蛭及其混淆品归为不同的四类;另外,含量测定结果显示,不同基原水蛭及其混淆品之间的含量存在一定差异,尿嘧啶、次黄嘌呤的含量均值依次为:蚂蟥＞水蛭＞柳叶蚂蟥＞菲牛蛭;黄嘌呤的含量均值依次为:蚂蟥＞水蛭＞菲牛蛭＞柳叶蚂蟥;水蛭胺C羧基衍生物的含量均值依次为:柳叶蚂蟥＞蚂蟥＞水蛭＞菲牛蛭;水蛭胺B的含量均值依次为:柳叶蚂蟥＞蚂蟥＞水蛭＞菲牛蛭.本研究所建立的方法可作为不同基原水蛭及其混淆品的质量评价方法,为水蛭药材的质量评价提供参考依据.

目的:探讨及比较宽体金线蛭和菲牛蛭对Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼的血管新生影响.方法:将受精后6~8 h(6~8hpf)的胚胎暴露在含不同浓度宽体金线蛭和菲牛蛭水提取物的胚胎培养液中,每24 h更换一次含药培养液.72 hpf时,在显微镜下观察发育形态和节间血管,测定48,72 hpf孵化率,72 hpf节间血管数目、心率.结果:在抑制血管新生方面,宽体金线蛭组浓度≥30μg·ml-1时,菲牛蛭组浓度≥20μg·ml-1时,斑马鱼节间血管数目均较空白组明显减少(P<0.01).毒性方面,在48 hpf,给药组浓度≥40μg·ml-1时,宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的孵化率均较空白组明显降低(P<0.01);在72 hpf,宽体金线蛭组斑马鱼的孵化率在100μg·ml-1时较空白组明显降低(P<0.01),而菲牛蛭组斑马鱼的孵化率在80μg·ml-1就明显降低(P<0.01).宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的卵黄囊、心囊无明显水肿,脊柱未弯曲;两组心率显著降低(P<0.01),但在正常心率范围内.结论:宽体金线蛭和菲牛蛭都具有抗血管生成活性,且菲牛蛭的抗血管生成活性强于宽体金线蛭.两者对斑马鱼发育有一定程度的影响,但毒性不大.

目的:利用制备的丝素固定化凝血酶分离纯化菲牛蛭中的水蛭素.方法:以抗凝血酶活力(ATU)回收率为指标进行牛蛭素的固定化凝血酶萃取,通过正交实验优化萃取及反萃取条件.最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定实验样品的纯度.结果:菲牛蛭素A萃取的最佳条件为:水蛭素初始浓度9 ATU/mL,温度30℃,pH4.30,时间45 min;反萃取温度30℃,pH 7.4,时间30 min,ATU回收率55.73％.菲牛蛭素B萃取的最佳条件为:水蛭素初始浓度9 ATU/mL,温度30℃,pH 5.2,时间45 min;反萃取温度30℃,pH 7.2,时间30 min,ATU回收率23.96％.菲牛蛭素A、B实验样品PAGE图均只有1条带.结论:该文利用制备的丝素固定化凝血酶可以有效的应用于菲牛蛭素的分离纯化.

运用Grimelius银染法对菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)消化管内嗜银细胞的分布和形态进行观察,并根据嗜银细胞的分布特点统计其分布密度.消化管除食道外各部位均有嗜银细胞分布,细胞染棕色或黑色;嗜银细胞基本位于上皮细胞之间和固有层内,主要呈圆形、椭圆形、锥体形和长条形等多种形态;部分细胞胞突明显,细胞内可见黑色分泌颗粒.嗜银细胞分布密度为颚片最高,嗉囊次之,直肠最低,食道内未检测出嗜银细胞.消化管各段嗜银细胞的形态特征和分布规律可能与其食性和消化生理活动密切相关.

目的:确定菲牛蛭传统炮制的科学性.方法:分别采用水提取法和仿生提取法提取菲牛蛭清水吊干品、活体冻干品、滑石粉烫制品、酒浸闷烘品中的抗血栓活性成分,以纤维蛋白平板法和纤维蛋白原平板法的透明圈面积为活性指标进行纤溶活性测定,并建立体外血栓模型,通过血凝块的失重比进一步测定抗血栓活性.结果:各炮制品均能使纤维蛋白平板产生透明圈.采用水提取法时,滑石粉烫制和酒浸闷烘后的菲牛蛭溶圈面积减小,纤溶活性降低,活性顺序为:清水吊干品>活体冻干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品,此结果与体外溶解血凝块的失重比结果一致;而采用仿生提取法时,结果均显示炮制使菲牛蛭纤溶活性及溶栓率升高,且活性顺序为:滑石粉烫制品>酒浸闷烘品>清水吊干品>活体冻干品.仿生提取法较水提取法更符合菲牛蛭经口服后在人体内的吸收过程,结果更有说服力.结论:传统的炮制方法不仅可以矫味矫臭,还可增强菲牛蛭的抗血栓活性作用.

目的:采取不同的提取方法研究菲牛蛭炮制前后抗凝活性变化.方法:分别采用水提取法及模拟胃肠道环境的仿生提取法提取菲牛蛭活体冻干品、清水吊干品、滑石粉烫制品、酒浸闷烘品中的活性成分,测定活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、抗凝血酶活性4个凝血指标,并采用Lorry法测定其蛋白含量,综合评价2种提取方法下的菲牛蛭及其炮制品的抗凝活性.结果:无论是水提取法,还是仿生提取法,APTF、PT、TT均显示炮制后抗凝活性降低,抗凝活性顺序为活体冻干品＞清水吊干品＞酒浸闷烘品＞滑石粉烫制品,此结果与抗凝血酶活性及蛋白含量顺序一致.结论:高温炮制方法会降低菲牛蛭的抗凝活性.

目的:通过特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)法结合微芯片电泳检测的方法,特异性鉴别宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3种水蛭品种.方法:针对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种的线粒体同源序列,设计区分正伪品水蛭以及分别鉴定3个品种水蛭样品的特异性引物;通过PCR和微芯片电泳检测的方法验证所设计引物的特异性;将验证得到的特异性引物进行整合,建立3个品种的特异性引物用于三重PCR的方法.结果:确定了用于区分宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种中正伪品的特异性引物KA;确定了宽体金线蛭特异性引物KT,日本医蛭特异性引物RI,菲牛蛭特异性引物FN;建立了3种特异性引物进行三重PCR鉴别3个品种水蛭药材的方法.结论:通过特异性引物结合三重PCR的方法,可以同步鉴定宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭的人为预混样品,鉴定结果准确,且用于三重PCR的特异性引物不存在引物之间相互结合或非特异性扩增的现象.

目的:在已进行的水蛭体外抗凝活性研究的基础上,进行体内抗凝活性验证,探索不同品种水蛭高温炮制的合理性.方法:ICR小鼠随机分为10组,空白对照组、模型组、阳性药肝素钠组、宽体金线蛭组(净制、烫制、酒制)、菲牛蛭组(活体冻干、清水吊干、烫制、酒制).各组小鼠分别灌胃给予相应药物7 d,空白对照组给予等体积生理盐水.各组小鼠末次给药60 min后尾静脉注射0.1％鞣花酸溶液建立高凝小鼠血瘀模型.采用毛细管法测定各组的凝血时间(CT),试剂盒测定贫血小板血浆(PPP)中活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)以及凝血酶原时间(PT).结果:与模型组比较,宽体金线蛭及其各炮制品均可显著延长小鼠CT,其烫制品和酒制品可显著延长小鼠APTT,烫制品可显著延长小鼠TT(P＜0.01);菲牛蛭活体冻干品、清水吊干品、酒制品可显著延长小鼠CT,且活体冻干品和清水吊干品可显著延长小鼠APTT,清水吊干品可显著延长小鼠TT(P＜0.01).各水蛭组小鼠PT无明显变化.结论:宽体金线蛭经高温炮制后体内抗凝活性升高;菲牛蛭经高温炮制后体内抗凝活性降低;水蛭发挥抗凝作用的途径可能为内源性凝血途径及共同凝血途径.

急性白血病是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,骨髓中白血病细胞的大量增殖抑制机体正常造血,患者临床表现多以贫血、出血为主.但疾病同时会对正常凝血纤溶系统产生影响,部分患者在诊断前或化疗过程中会发生血栓事件,严重影响了其治疗及预后[1].目前针对该类患者无标准治疗方案,普遍采用低分子肝素或新型口服抗凝剂,但同时也显著增加患者出血的风险[2].云南省第一人民医院血液科采用菲牛蛭冻干粉成功治疗2例急性白血病合并肺栓塞患者,现报告如下.本研究经云南省第一人民医院医学伦理委员会批准(No.KHLL2019-KY022).

目的 通过微性状鉴别的方法鉴定水蛭及其混伪品,结合DNA鉴别佐证微性状鉴别的准确性,并对市售水蛭药材的重金属含量和酸碱度进行测定,综合评价市售水蛭药材的质量.方法 采用3D景深合成技术和3D大图拼接技术对市售水蛭进行微性状鉴别,查阅相关文献比对鉴别,并测定其Cytb序列进行结果验证.采用ICP-MS法测定其重金属的含量及酸碱度.结果 通过微性状鉴别可以区分水蛭及其混淆品,其不同品种的水蛭体背颜色及纹理、颚齿的形态、生殖孔所在的环节等微性状特征有明显区别.共鉴定出正品宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、伪品菲牛蛭Poecilobdella ma-nillensis和Erpobdella bscur.DNA鉴别结果与微性状鉴别结果一致.市售水蛭的砷(As)含量容易超标,酸碱度一般均符合规定.结论 微性状鉴别可以准确的鉴别水蛭及其混伪品,该方法操作简便、快捷.