目的:采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽.方法:利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定.结果:经过虚拟酶切共得到 3317 条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到 1 条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为-427.506 kJ·mol-1.凝血酶Arg233 残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸.该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间.结论:利用分子模拟技术有效筛选出 1 条宽体金线蛭抗凝活性肽,并经过抗凝实验验证,表明"模拟+实验"的活性肽筛选策略切实可行,该研究思路可为动物类中药物质基础研究提供参考.

目的:研究不同饥饿再投喂方式对宽体金线蛭幼蛭生长、消化酶及抗氧化酶活性的影响,为其适宜养殖投喂策略提供参考.方法:选用平均体重为(0.094±0.01)g的幼蛭为研究对象,处理方式为饥饿7、14、21 d,再分别恢复投喂23、16、9 d,养殖周期均为30 d.结果:宽体金线蛭幼蛭饥饿7 d恢复投喂后,除增重率外,其他生长指标与对照组无显著差异,随着饥饿时间的延长,幼蛭补偿生长现象逐渐消失.饥饿14 d,幼蛭淀粉酶活性显著高于对照组(P＜0.05).饥饿7 d,幼蛭脂肪酶活性显著高于对照组(P＜0.05).经恢复投喂,各组幼蛭消化酶活性与对照组均无显著差异.饥饿7 d,幼蛭各抗氧化酶活性(SOD、CAT、MDA、GPx)与对照组之间无显著差异.长期饥饿对幼蛭的抗氧化酶活性存在显著影响(P＜0.05),幼蛭饥饿21 d,经短期再投喂,其抗氧化酶活性(SOD、CAT、GPx、T-AOC)仍显著高于对照组(P＜0.05).结论:在该实验条件下,幼蛭饥饿7 d后恢复投喂,其具有完全补偿生长效应,但随着饥饿时间的延长,其补偿生长效应逐渐消失,且幼蛭体内强烈氧化还原反应短时间内无法消除.

目的:探讨及比较宽体金线蛭和菲牛蛭对Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼的血管新生影响.方法:将受精后6~8 h(6~8hpf)的胚胎暴露在含不同浓度宽体金线蛭和菲牛蛭水提取物的胚胎培养液中,每24 h更换一次含药培养液.72 hpf时,在显微镜下观察发育形态和节间血管,测定48,72 hpf孵化率,72 hpf节间血管数目、心率.结果:在抑制血管新生方面,宽体金线蛭组浓度≥30μg·ml-1时,菲牛蛭组浓度≥20μg·ml-1时,斑马鱼节间血管数目均较空白组明显减少(P<0.01).毒性方面,在48 hpf,给药组浓度≥40μg·ml-1时,宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的孵化率均较空白组明显降低(P<0.01);在72 hpf,宽体金线蛭组斑马鱼的孵化率在100μg·ml-1时较空白组明显降低(P<0.01),而菲牛蛭组斑马鱼的孵化率在80μg·ml-1就明显降低(P<0.01).宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的卵黄囊、心囊无明显水肿,脊柱未弯曲;两组心率显著降低(P<0.01),但在正常心率范围内.结论:宽体金线蛭和菲牛蛭都具有抗血管生成活性,且菲牛蛭的抗血管生成活性强于宽体金线蛭.两者对斑马鱼发育有一定程度的影响,但毒性不大.

目的:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行不同分子量的含量测定和物质分离,获得最优条件.方法:采用不同分子通透性的透析膜对宽体金线蛭活性溶液进行分子量的含量测定.再分别采用大孔树脂、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF对宽体金线蛭活性溶液进行纯化.通过考察不同纯化条件以达到分离有效物质的目的,并结合体外抗凝实验对最佳组分进行活性检测.结果:分别采用500 Da、1000 Da、3000 Da的透析膜对活性溶液进行分子量含量测定,得出＜ 500 Da的物质占37.6％;500 Da ～ 1000 Da的物质占到18.5％;1000 Da～ 3000 Da的物质占28.1％;＞3000 Da物质占到15.7％.采用大孔树脂DA201-C处理得出50％乙醇洗脱液具有很好的活性.再采用Q Sepharose FF、SP Sepharose FF分别对宽体金线蛭活性溶液进行处理,采用不同洗脱剂进行洗脱然后进行活性验证得出1.0％ NaCl的pH值=8.5的Tris缓冲溶液洗脱组分活性比较强.结论:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行研究,获得较纯的活性组分,为后期的继续研究做好基础.

目的 对蛭类转录组进行SSR分析,是开发功能分子标记、开展对药用蛭类资源的开发利用及进行遗传背景监测的必要手段.方法 利用与医学密切相关的医蛭科棒纹牛蛭Poecilobdella javanica和日本医蛭Hirudo nipponia、黄蛭科宽体金线蛭Whitmania pigra和山蛭科洞穴山蛭Heamadipsa cavatuses sp.nov.共14个样本,通过RNA测序及转录组分析,筛选吸血差异unigene,并比较4个种的SSR标记特征和分布,用于挖掘抗凝血相关功能EST-SSR.结果 通过SSR密度分析发现,SSR在棒纹牛蛭、日本医蛭、宽体金线蛭和洞穴山蛭转录组中的间隔长度为4 723、6 026、8 059、8 144 bp;SSR组成分析发现三碱基重复的基序占蛭类SSR类型组成中绝大多数;另外,洞穴山蛭的SSR组成与其他3种存在明显区别.比较4种吸血蛭吸血前后转录组中表达丰度显著差异的unigene群,发现4种蛭中包含SSR且抗凝血相关的重叠unigene类群在转录组中呈较高的片段多态性.结论 unigene片段长度、SSR的密度、组成和分布特点能反映物种之间的分类关系;4种蛭重叠的抗凝血相关分子功能对应的EST-SSR,可作为抗凝血相关的功能分子标记侯选EST-SSR.

为了解蚂蟥性腺发育周期内性类固醇激素变化规律,采用酶解、萃取以及UPLC-MS/MS技术测不同月龄蚂蟥体内性类固醇激素含量变化趋势.结果表明:蚂蟥体内雌酮、雌三醇、睾酮和孕酮含量均呈M型变化趋势,均在6月龄达最大值,9月龄最低,10～11月龄开始轻微上升,其中睾酮和孕酮另一个小峰值均出现在2月龄,而雌酮和雌三醇均出现在8月龄.1～4月龄睾酮和孕酮含量稍高于雌三醇,5月龄开始雌酮和雌三醇激素含量稍高于睾酮和孕酮.综上,蚂蟥体内性类固醇激素含量随性腺成熟呈逐渐上升、排放期后迅速下降趋势,提示蚂蟥雌激素、雄激素和孕激素之间的比例可能与其性腺发育的特殊性存在极大相关性.

目的:弄清宽体金线蛭(Whitmania pigra)苗期最适饵料.方法:以宽体金线蛭苗(体质量0.1140±0.0424 g)作为研究对象,实验时间为20d,分别投喂耳萝卜螺(Radix auricularia)(体质量0.1981±0.1113 g)和方形环棱螺(Bellamya quadrata)仔螺(体质量0.0356±0.0181 g),记录蛭苗对两种饵料的摄食数量,体重变化,水质变化等特征.结果:宽体金线蛭苗会积极采食萝卜螺和方形环棱螺仔螺,方形环棱螺仔螺组几乎无残饵,但萝卜螺组残饵较多;萝卜螺组体质量是方形环棱螺仔螺组的1.7倍;萝卜螺组饲养6d内氨氮、亚硝酸盐、硫化物指标在第6天分别达到7.81±2.33 mg/L、2.11±0.81 mg/L、0.13±0.03 mg/L,显著高于方形环棱螺仔螺组.结论:萝卜螺和方形环棱螺仔螺两种饵料均是宽体金线蛭苗适口饵料,萝卜螺作为饵料生长速度更快,但残饵较多,水质容易败坏.

目的 研究江苏省不同地区宽体金线蛭养殖性能.方法 收集苏州张家港市、泰州海陵区、扬州高邮市和盐城建湖县共四个地区野生宽体金线蛭青年苗,在室外水泥池进行人工养殖实验.结果 苏州张家港和泰州海陵地区宽体金线蛭青年苗平均增重倍数为4.67和4.72,扬州高邮和盐城建湖地区青年苗平均增重倍数分别为3.63和3.26,前二个地区青年苗平均增重倍数显著高于后二个地区平均增重倍数(P＜0.05);苏州张家港、泰州海陵、扬州高邮和盐城建湖四个地区青年苗平均成活率分别为85.20％、94.85％、91.58％和91.15％,苏州张家港地区青年苗养殖成活率显著低于其它三个群体(P＜0.05).结论 泰州海陵地区青年苗最适合在泰州地区养殖,苏州张家港地区青年苗次之.

目的:研究宽体金线蛭产茧后生长特性及主要消化酶活性,为产茧后亲蛭处理提供理论依据.方法:选择性成熟宽体金线蛭利用网箱进行人工繁殖,繁殖结束后在室内条件下开展为期20 d的养殖实验,实验分饥饿组和对照组,养殖期间定期测量体重和统计成活率,养殖结束后测定出于率和主要消化酶活性.结果:饥饿组在实验期间不断死亡,最后平均成活率为51.67％;对照组前期亲蛭少量死亡,实验中后期持续死亡,养殖平均成活率为65.00％,与饥饿组之间差异显著.饥饿组实验初期体重迅速增长,之后逐渐下降,最后基本恢复到实验前水平,实验期间体重平均增长率为-0.53％;对照组在实验前期体重增加后出现小幅下降,之后体重持续增加,最后恢复到产茧前水平,实验期间体重平均增长率为40.23％.产茧结束后亲蛭出干率为22.14％,饥饿实验结束后饥饿组和对照组出干率分别为13.30％和12.75％,二者之间差异不显著,但与亲蛭产茧结束时出干率之间差异极显著.宽体金线蛭胰蛋白酶活性高于淀粉酶和脂肪酶活性,饥饿处理引起宽体金线蛭胰蛋白酶活性增强、淀粉酶活性下降,二者在饥饿组和对照组中差异显著.结论:宽体金线蛭产茧后短期养殖体重可以恢复到产茧前水平.

目的:建立Native-PAGE结合Western blot检测水蛭活性多肽与凝血酶相互作用产物的方法,探究水蛭有效抗凝成分.方法:本研究分别提取宽体金线蛭、日本医蛭两种水蛭虫体总蛋白及日本医蛭唾液蛋白,用凝血酶滴定法测定其抗凝血酶活性,Western blot检测凝血酶-活性多肽复合体.结果:研究发现两种水蛭Native-PAGE-WB均检测到凝血酶-活性多肽复合体,且SDS-PAGE-WB检测到复合体变性后产生凝血酶条带.结论:建立的Native-PAGE-WB法可有效检出水蛭活性多肽和凝血酶相互作用产物,且发现同水蛭素类似,宽体金线蛭活性抗凝多肽与凝血酶在体外也能形成稳定的蛋白复合体.