目的 建立蒙花锚肝宁片的鉴别及含量测定方法.方法 采用薄层色谱(TLC)法对椭圆叶花锚有效成分1-羟基-3,4,5-三甲氧基(口山)酮和熊果酸进行定性鉴别,采用高效液相色谱(HPLC)法测定蒙花锚肝宁片中有效成分木犀草素、1-羟基-3,4,5-三甲氧基(口山)酮和当药苷的含量.结果 在TLC色谱中,1-羟基-3,4,5-三甲氧基(口山)酮和熊果酸色谱鉴别斑点清晰,且阴性样品无干扰;HPLC测定木犀草素、1-羟基-3,4,5-三甲氧基(口山)酮和当药苷三种成分分别在0.0028～0.0560μg、0.0715～1.430 μg、0.0020～0.0402 μg内与峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率在96.76％～99.26％(RSD＜1.3％).结论 该方法专属性强,简便可行,灵敏度高,能有效的控制蒙花锚肝宁片的内在质量.

本实验采用微波消解-电感耦合等离子体-发射光谱法(ICP-OES)测定了中国仅有的龙胆科花锚属的两个种花锚和椭圆叶花锚中21种矿物元素含量.实验中各元素相关系数r≥ 0.9990,线性关系良好,加标回收率在86％～106％之间,RSD≤4.35％,具有较好的准确度和精确度.结果表明,花锚和椭圆叶花锚均含有丰富的矿物元素,尤以Ca、Mg、Fe含量最高.椭圆叶花锚中Ca、Mg含量较高,其Ca含量是花锚的1.6倍;Be、Cd、Co、Li、Mo、Pb、Sb、T18种元素在二者中含量基本相同;其余11种元素在椭圆叶花锚中含量较低.结合标本采集地的土壤背景值,推测植物中元素含量与其所处生境有关.通过对两种花锚植物资源元素含量的比较分析,可为其深入研究与开发利用提供一定的参考.

基于RAD-seq简化基因组测序技术获得椭圆叶花锚(Halenia ellipiticaD.Don)简化基因组水平上的序列信息并开发SSR分子标记.利用SR search软件检测而得到双端各有至少100 bp的五种类型的SSR(二、三、四、五、六核苷酸)位点共6 201个,并成功设计其中3 865个SSR引物.在能成功设计引物的SSR位点中,三核苷酸SSR位点最多;重复序列长度包括17种(12～ 36 bp);重复序列的基序共达316种,其中五核苷酸基序种类最多(91种).从中挑选65对可对应五种SSR类型的引物,经梯度PCR检验后,利用椭圆叶花锚的4个居群32个个对可扩增的引物进行PCR和聚丙烯酰氨凝胶电泳检测,其中14对引物能在绝大多数个体中扩增,且13对具多态性.13个多态性位点的等位基因数量均值为5.462,多态性较高且不连锁(P＜0.05);其中10个位点在多数居群中偏离哈迪温伯格平衡(P＜0.01)且存在较高的纯合子数量(观测杂合度H.均值0.226);近交系数在-0.443～1,均值为0.656;基因流Nm为0.474.

龙胆科龙胆属Gentiana秦艽组Sect.Cruciata多种植物作为中药秦艽及藏药解吉(())的基原,具有重要的药用价值.在课题组前期品种整理及遗传背景分析基础上,本文分别测定秦艽组10种23个居群69份样品以及外类群椭圆叶花锚Halenia elliptica3份样品的线粒体nad1基因第2内含子区(had 1/b-c)以及nad5基因第4内含子区(nad5/d-e)部分序列,对其在秦艽组植物的分子系统发育分析及物种鉴定中的意义进行评价.结果显示:nad1/b-c具一粗壮秦艽G.robusta King ex Hook.f.稳定变异位点;同时,对粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.及西藏秦艽G.tibetica King ex Hook.f.有一定物种分辨率;nad5/d-e序列相似度高,仅大叶秦艽G.macrophylla Pall.、黄管秦艽G.officinalis H.Smith及管花秦艽G.siphonantha Maxim.ex Kusnez.存在种内不同基因型.进而基于粗壮秦艽G.robusta King ex Hook.f.nad 1/b-c物种分子标记,设计一特异鉴定引物,建立粗壮秦艽特异性引物-PCR鉴定方法.本工作可为协同进化不完全、遗传背景复杂多样的中藏药高山基原植物DNA条形码的构建提供新思路.

目的:对藏药"蒂达"的3种基源植物紫红獐牙菜、青叶胆和椭圆叶花锚进行亲缘关系研究.方法:利用简单重复序列区间(ISSR)分子标记技术对紫红獐牙菜9个样品(样品ZT-1～ZT-5采自大理苍山感通寺,样品ZC-1～ZC-4采自大理宾川县)、青叶胆2个样品(QYD-1～QYD-2)和椭圆叶花锚2个样品(HM-1～HM-2)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增.采用青叶胆的DNA基因组为模板DNA进行引物筛选,对筛选得到的8条引物进行PCR反应;对PCR扩增产物进行人工读带,建立原始数据矩阵,并计算多态性条带比率;同时,采用NTSYS 2.1软件计算遗传相似系数,并选择UPGMA法绘制聚类图.结果:通过8条ISSR引物共反应获得113条清晰可辨的PCR扩增产物条带,多态性位点百分率为100％.紫红獐牙菜、青叶胆和椭圆叶花锚3个品种共13个样品的遗传相似系数在0.301～0.500之间;紫红獐牙菜9个样品的种内遗传相似系数在0.752～0.929之间.聚类分析结果显示,当距离线为0.410时,可将13个样本分为3个类群,即青叶胆、椭圆叶花锚、紫红獐牙菜;当距离线为0.780时,可将紫红獐牙菜的9个样品分为2个亚类,一个亚类只有苍山感通寺采集的样品ZT-1,另一个亚类含有其余8个样品.结论:利用ISSR分子标记技术能从分子水平对紫红獐牙菜、青叶胆和椭圆叶花锚进行鉴别.紫红獐牙菜与青叶胆、椭圆叶花锚存在一定的亲缘关系,但亲缘关系相对较远、遗传差异较大;大理地区两个不同地点产紫红獐牙菜的遗传差异较小、亲缘关系较近,但表现出丰富的遗传多样性.

探究2种(口山)酮化合物1-羟基-2,3,4,8-四甲氧基(口山)酮(简称Fr15)和1-羟基-2,3,4,6-四甲氧基(口山)酮(简称Fr17)对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用,结合转录组学进一步研究其增殖抑制的作用机制.通过细胞计数法检测2种(口山)酮化合物Fr15和Fr17(0,0.03,0.15,0.3 mmoL·L-1)对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞仪检测2种化合物对HepG2细胞周期的影响;荧光显微镜观察细胞中自噬体形成的数量变化;Western blot法检测细胞中自噬标志性蛋白SQSTM 1(p62)及微管相关蛋白1轻链3Ⅰ/Ⅱ(LC3 Ⅰ/Ⅱ)的表达情况;对照组与实验组通过RNA-seq转录组学测序技术,分析差异表达基因;qRT-PCR法验证测序差异表达基因对比结果.结果 发现细胞经化合物Fr15和Fr17处理后,随着药物浓度和时间的增加HepG2细胞的增殖受到了抑制,流式细胞仪检测发现化合物Fr15和Fr17对HepG2细胞周期影响不大.荧光显微镜表明随着化合物Fr15和Fr17浓度的增加,细胞中自噬体数量逐渐变多.Western blot结果表明加药后的细胞p62蛋白表达下降,同时LC3Ⅱ蛋白表达明显升高.RNA测序结果分析Fr15和Fr17,分别得到26 102个及52 351个差异表达基因.KEGG分析发现化合物处理后对细胞自噬信号通路影响较大.qRT-PCR验证6个与自噬相关的表达上调基因,其变化趋势与测序结果一致,6个基因均出现上调趋势.2种(口山)酮化合物Fr15和Fr17可能通过诱导HepG2细胞发生细胞自噬来抑制其增殖.

藏药“解吉那保”(()),能消肿,治白喉等.基于民族药物学考察、自然分布区广泛取样(6省区20个居群163株个体),结合模式标本查阅与形态学比较,将其主流品种之一鉴定为龙胆科龙胆属Gentiana粗茎秦艽Gentiana crassicaulis.粗茎秦艽,我国特有物种,仅在西藏、云南、四川、贵州、青海及甘肃等省区有分布,多见于海拔2 100～4 500m的高山草甸、林下及林缘.应用AFLP技术,以龙胆科花锚属椭圆叶花锚Halenia elliptica及龙胆属近缘种麻花艽G.straminea为外类群,构建DNA指纹谱.从64对引物组合中筛选出12对,共扩增出315个条带,其中多态性条带254条,占比为80.63％.粗茎秦艽种内遗传多样性丰富,遗传变异主要存在于居群间(87％),居群内部遗传变异较小(13％).非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类树物种间拓扑结构与经典分类学观点相一致;物种内分为两大支:支I由西藏、甘肃、青海及四川各居群组成,支Ⅱ由贵州及云南各居群组成.PCA分析及Mantel检验等均表明粗茎秦艽居群间遗传距离与空间地理距离具有显著的正相关关系.同时,结合SSR与SNP标记,探讨了四川康定县居群S1的分化问题.本工作可为藏药“解吉那保”种质资源保护、药材生药学鉴定及道地性探究等提供基础资料.

本文旨在利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,通过网络药理学和分子对接方法,探究椭圆叶花锚抗肝炎的潜在分子作用机制.首先通过UPLC-Q-TOF-MS/MS分析椭圆叶花锚主要化学成分,并利用Swiss Target Prediction数据库预测其作用靶点,将结果与在DisGeNET、GeneCards数据库中检索肝炎相关靶点求交集获得关键核心靶点.其次通过String数据库构建蛋白相互作用网络,将结果导入Cytoscape 3.6.0软件构建蛋白互作网络及成分-靶点-通路网络.然后通过DAVID数据库对靶点基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,最后利用Autodock Vina等软件将网络中预测到的潜在活性成分与核心靶点进行分子对接验证.结果 显示39个关键抗肝炎作用的活性成分和33个潜在靶点.主要通过白细胞迁移、一氧化氮生物合成过程的正调控、血小板活化、细胞外调节蛋白酶ERK1和ERK2级联的正调控、磷脂酰肌醇3-激酶信号转导的调控等生物过程,以及TNF、PDK、Toll-like receptor、FoxO、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等关键信号通路,发挥抗肝炎的作用.

目的:梳理川甘产藏药"解吉嘎保"()主流品种,并基于DNA条形码对其进行分子生药学鉴定研究.方法:在川甘产区进行民族植物学考察,共采集11个居群55份样品标本,对其进行基原、药材性状、显微鉴定及质量评价;并基于课题组前期相关工作进一步筛选DNA分子标记,测定各样品及西藏产麻花艽与秦艽组Sect.Cruciatar 9个近缘物种的叶绿体基因组psbA-trnH、rpl20-rps12及线粒体基因组nad1 b/c序列,以龙胆科花锚属椭圆叶花锚Halenia elliptica及龙胆属Gentiana高山龙胆组Sect.Frigidat直萼龙胆Gentiana erecto-sepala为外类群,邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树,评价各片段的系统学意义,构建DNA条形码.结果:①川甘产藏药解吉嘎保的主流品种为龙胆科龙胆属秦艽组植物麻花艽Gentiana straminea.②各样品中龙胆苦苷和马钱苷酸总含量符合《中华人民共和国药典(2020年版)》的标准.③叶绿体psbA-trnH序列可将秦艽组10个物种分为两类,麻花艽与粗壮秦艽Gentiana robusta为一类,其余8个近缘物种为另一大类;线粒体nad1 b/c序列可进一步区分麻花艽与粗壮秦艽;叶绿体rpl20-rps12序列则具有麻花艽种下不同产地间分辨率.因此,构建川甘产藏药解吉嘎保主流品种麻花艽基于叶绿体psbA-trnH、线粒体nad1 b/c、叶绿体rpl20-rps12三个片段的组合型DNA条形码.结论:本研究明确了川甘产藏药解吉嘎保的主流品种来源,并构建了其DNA条形码鉴定方法,可为解吉嘎保的基原植物鉴定、道地藏药材质量标准的提升及龙胆科植物系统发育研究等提供基础资料.

异型花是青藏高原特有的一年生草本植物.为了更好地利用和保护这一重要的植物资源,本研究开发了异型花的多态性微卫星标记.首先,基于限制性位点相关DNA测序(RAD-seq)技术,开发了异型花14个多态性微卫星位点和2个单态性微卫星位点的引物;随后,对异型花的3个自然居群的57个个体的14个位点进行了分析.结果显示:14个位点观察到的等位基因数为4～7个,平均为5.071个;期望杂合度范围为0.003～0.312(平均值为0.194),而观测杂合度范围为0～0.281(平均值为0.047).其中,仅有3对引物在龙胆科的椭圆叶花锚中具有通用性.本研究开发的多态标记对研究异型花种群结构和遗传多样性具有重要意义.