目的 基于代谢组学方法研究不同加工方法下粗茎秦艽Gentiana crassicaulis药材次生代谢化合物的差异,为优化粗茎秦艽药材的加工及干燥方法提供科学依据.方法 收集云南丽江产粗茎秦艽药材,分别进行产地和药厂加工,加工方式包括切片、原个子(不切片),干燥方式包括烘干、晒干和"发汗".采用超高效液相色谱-离子阱-静电场轨道阱质谱(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技术,结合多元统计分析方法,对各样品的次生代谢产物进行分析,筛查其差异性的特征化合物.结果 共鉴定出44个化学成分.主成分分析(principal component analysis,PCA)结果表明,根与芦头(根茎)的化学成分存在较大的差异,根的切片组、原个子组有明显区分.正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)表明,三年生药材质量优于二年生药材,根的质量优于芦头,切片组优于原个子组,不同干燥方法中晒干组药材的质量较优,药厂加工药材质量均优于产地加工药材,并分析得到各组间主要差异化合物.结论 粗茎秦艽药材加工时,建议选用三年生药材,去除芦头部位,并进行趁鲜切片及晒干处理.可为粗茎秦艽药材初加工工艺、质量控制与合理应用提供科学资料.

为了探究影响粗茎秦艽(Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.)种子休眠的因素,破除休眠,寻找其种子快速萌发的方法,以干燥的粗茎秦艽种子为材料,测定种子吸水率及粗提物的活性,使用不同浓度的赤霉素(GA3)、高锰酸钾(KMnO4)、聚乙二醇(PEG6000)和过氧化氢(H2O2)溶液进行浸种处理,比较不同处理条件对粗茎秦艽种子萌发的影响.结果显示,粗茎秦艽种皮对种子吸水没有明显阻碍作用;不同浓度的种子粗提物对白菜、小麦的萌发和生长均表现出抑制作用;不同浓度的粗提物对粗茎秦艽种子自身的萌发也表现出一定的抑制作用,当粗提物浓度达到0.1 g/mL时,抑制作用最显著(P＜ 0.05);高锰酸钾处理可提高粗茎秦艽种子的萌发率,浓度为1.5％时效果较显著(P＜0.05),而过氧化氢处理对粗茎秦艽种子的萌发效果不如前者,此外,用500 mg/L的赤霉素浸种和300 mg/L的聚乙二醇预处理也可显著打破粗茎秦艽种子休眠(P＜0.01).研究结果表明粗茎秦艽种子的内源抑制物是影响其休眠的因素之一;种皮的机械阻碍也在一定程度上影响了种子萌发;粗茎秦艽种子具有综合性休眠特性.高锰酸钾预处理、赤霉素浸种和聚乙二醇引发均可打破种子休眠、缩短种子出芽时间,提高种子的发芽能力.

目的 通过化学成分测定,评价远红外干燥、真空干燥、冷冻干燥、阴干、烘干、“发汗”干燥对粗茎秦艽品质的影响.方法 采用UPLC-ESI-HRMSn测定秦艽中4个环烯醚萜类成分(獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苷)和4个黄酮类成分(木犀草素、异牡荆素、芹菜素、山柰酚)质量分数.并结合单因素方差分析、聚类分析、逼近理想值排序法(TOPSIS)分析综合评价不同干燥方式所得样品的品质,确定最佳干燥方式.结果 不同干燥方法样品的獐牙菜苦苷差异不显著,龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苷、木犀草素、异牡荆素、芹菜素和山柰酚差异明显.其中,4个环烯醚萜类成分在冷冻干燥中保留最佳;4个黄酮类成分在“发汗”干燥中保留最佳.各成分在阴干样品中质量分数最低.聚类分析及TOPSIS分析表明“发汗”干燥具有与冷冻干燥相似的品质,且品质最好,其次是烘干干燥和远红外干燥,阴千干燥的样品品质最差.结论 不同干燥方式对秦艽药材品质的影响值得关注.研究表明《中国药典》2015年版收载秦艽“发汗”的干燥方法具有科学性.但传统“发汗”过程时间较长,为了提高干燥效率,进一步研究方向应关注“发汗”干燥结合现代干燥技术如热风干燥、冷冻干燥、真空干燥以保证秦艽药材稳定品质的基础上缩短干燥时间.

目的 分析粗茎秦艽Gentiana crasicaulis不同部位化学成分的差异.方法 运用四级杆-静电场轨道阱高分辨液质联用(UPLC-ESI-HRMSn)技术对粗茎秦艽不同部位的化学成分进行采集,所得数据运用主成分分析(PCA)法与正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)处理,粗茎秦艽不同部位的差异指标成分通过精准的一级质谱质荷比和二级质谱碎片离子同对照品图谱和软件数据库搜索以及相关文献报道成分进行判别分析.结果 共鉴定36个成分,包括环烯醚萜类12个、黄酮类11个、三萜类4个、酯类2个、木脂素类1个、其他类6个,其中4个成分首次在该植物中报道,通过OPLS-DA,筛选出根与地上部分间16个差异性较大的化学成分.结论 粗茎秦艽环烯醚萜类差异成分主要分布于根部,而黄酮类和三萜类差异成分则主要集中于地上部分(花和茎叶),为粗茎秦艽资源的综合利用提供了依据.

龙胆科龙胆属Gentiana秦艽组Sect.Cruciata多种植物作为中药秦艽及藏药解吉(())的基原,具有重要的药用价值.在课题组前期品种整理及遗传背景分析基础上,本文分别测定秦艽组10种23个居群69份样品以及外类群椭圆叶花锚Halenia elliptica3份样品的线粒体nad1基因第2内含子区(had 1/b-c)以及nad5基因第4内含子区(nad5/d-e)部分序列,对其在秦艽组植物的分子系统发育分析及物种鉴定中的意义进行评价.结果显示:nad1/b-c具一粗壮秦艽G.robusta King ex Hook.f.稳定变异位点;同时,对粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.及西藏秦艽G.tibetica King ex Hook.f.有一定物种分辨率;nad5/d-e序列相似度高,仅大叶秦艽G.macrophylla Pall.、黄管秦艽G.officinalis H.Smith及管花秦艽G.siphonantha Maxim.ex Kusnez.存在种内不同基因型.进而基于粗壮秦艽G.robusta King ex Hook.f.nad 1/b-c物种分子标记,设计一特异鉴定引物,建立粗壮秦艽特异性引物-PCR鉴定方法.本工作可为协同进化不完全、遗传背景复杂多样的中藏药高山基原植物DNA条形码的构建提供新思路.

藏药解吉(()()),来源为龙胆科龙胆属Gentiana秦艽组(Sect.Cruciata)多种高山植物;可分为解吉那保(具蓝紫色花的)与解吉嘎保(具白色花的)两个品种.首次以解吉那保基原植物之一——长梗秦艽Gentiana waltonii Burk.与解吉嘎保基原植物之一——粗壮秦艽Gentiana robusta King ex Hook.f为模式植物,分别构建其根、茎、叶、花转录组数据库.对原始数据进行除杂,将质控后得到的所有高质量序列进行de novo拼接,分别得到长梗秦艽79 455条、粗壮秦艽78 466条unigene,平均长度分别为834 bp和862 bp.根据GO功能分类,可将unigene分为3大类65分支;根据KOG功能可将unigene分为25类;KEGG代谢通路分析分别发现长梗秦艽和粗壮秦艽中315条、340条unigene参与到20个次生代谢标准通路中.环烯醚萜苷类为藏药解吉及中药秦艽类、龙胆类、当药及青叶胆等药材的指标性成分及活性成分之一,分析结果显示:分别有80条、57条unigene参与编码环烯醚萜苷类合成途径中的24个关键酶,且在不同部位中的表达存在差异;还发现多个SSR和SNP、InDel位点.本工作可为藏药材基原植物遗传图谱构建,分子标记开发,功能基因掌握,有效成分累积规律、道地性形成机制、藏药材品种科学内涵的探讨,分子育种及濒危藏药高山植物就地保护等提供基础科学资料.

目的 建立粗茎秦艽Gentiana crassicaulis透皮吸收液中多种环烯醚萜类化学成分含量测定方法,并对粗茎秦艽体内外经皮渗透特性进行研究,为粗茎秦艽经皮给药制剂的研发、临床用药和传统剂型改革提供科学依据.方法 在课题组前期研究的基础上,采用醇提法制备粗茎秦艽提取液,选用3种常用的透皮促渗剂氮酮、冰片和丙二醇,利用HPLC定量评价单一促渗剂或二元复合促渗剂对粗茎秦艽中马钱苷酸、山栀苷甲酯、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐芽菜苷5种主要成分的体外经皮渗透特性的影响;以龙胆苦苷、马钱苷酸和獐芽菜苦苷3种成分为评价指标研究粗茎秦艽醇提物在活体小鼠皮肤模型的渗透特性.结果 与对照组相比,促渗剂的使用可显著增加粗茎秦艽中5种主要成分的体外吸收,A(5％氮酮)、B(5％冰片)、C(5％丙二醇)、A+B(2.5％氮酮+2.5％冰片)、A+C(2.5％氮酮+2.5％丙二醇)、B+C(2.5％冰片+2.5％丙二醇)5组中马钱苷酸、山栀苷甲酯、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐芽菜苷的透皮吸收速率(J)分别可达12.306 0、1.248 8、4.187 5、153.030 0、5.012 6μg/(cm2·h),促渗效果分别是对照组的9.73、2.57、13.94、15.92、8.08倍.其中,A+C组,即2.5％氮酮+2.5％丙二醇组体外促渗效果最为明显.体内经皮渗透实验表明,与空白组对比,2.5％氮酮+2.5％丙二醇组对于活体小鼠皮肤的促渗透效果表现较好.结论 氮酮和丙二醇对粗茎秦艽中马钱苷酸、山栀苷甲酯、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐芽菜苷5种主要成分有良好的促渗透效果,为研究粗茎秦艽经皮给药制剂质量控制奠定基础.

目的:观察光照对粗茎秦艽种子萌发及其过程中环烯醚萜类成分积累规律的影响.方法:将粗茎秦艽种子分为光照组和避光组,浸泡24h后置于21℃培养箱内培养,光照组的光照强度为605～ 710 lx.以种皮开裂露出胚根为发芽标志,记录每日种子的发芽情况.培养33 d后,分别统计光照组和避光组的种子发芽率、首次萌发时间与半数萌发时间,测量其子叶、胚轴、胚根的长度及胚轴直径.于培养过程中不同时间点取样,液质联用技术定性鉴别环烯醚萜类化合物,并对各成分含量进行相对定量分析.比较光照组和避光组种子萌发过程中环烯醚萜类成分含量的变化趋势.结果:①培养33 d后,光照组平均发芽率为76％,避光组平均发芽率为88％;光照组种子首次萌发时间略晚于避光组;光照组和避光组的半数萌发时间分别为培养16、15 d.②避光组子叶未见发育,光照组子叶发育明显.避光组的胚轴长度和胚轴直径明显大于光照组(P＜0.01),光照组的胚根长度明显大于避光组(P＜0.01).③液质联用定性鉴别出8种环烯醚萜类化合物.种子萌发过程中,龙胆苦苷含量逐渐增加,而马钱苷酸含量逐渐减少;环烯醚萜衍生物gentistraminosides B、macrophylloside A、macrophylloside B及其同分异构体含量逐渐增加.光照组的龙胆苦苷和以上4种环烯醚萜衍生物的含量高于避光组.结论:光照对粗茎秦艽种子萌发及其胚轴伸长具有一定抑制作用,并对萌发过程中环烯醚萜类成分的积累产生影响.

藏药“解吉那保”(()),能消肿,治白喉等.基于民族药物学考察、自然分布区广泛取样(6省区20个居群163株个体),结合模式标本查阅与形态学比较,将其主流品种之一鉴定为龙胆科龙胆属Gentiana粗茎秦艽Gentiana crassicaulis.粗茎秦艽,我国特有物种,仅在西藏、云南、四川、贵州、青海及甘肃等省区有分布,多见于海拔2 100～4 500m的高山草甸、林下及林缘.应用AFLP技术,以龙胆科花锚属椭圆叶花锚Halenia elliptica及龙胆属近缘种麻花艽G.straminea为外类群,构建DNA指纹谱.从64对引物组合中筛选出12对,共扩增出315个条带,其中多态性条带254条,占比为80.63％.粗茎秦艽种内遗传多样性丰富,遗传变异主要存在于居群间(87％),居群内部遗传变异较小(13％).非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类树物种间拓扑结构与经典分类学观点相一致;物种内分为两大支:支I由西藏、甘肃、青海及四川各居群组成,支Ⅱ由贵州及云南各居群组成.PCA分析及Mantel检验等均表明粗茎秦艽居群间遗传距离与空间地理距离具有显著的正相关关系.同时,结合SSR与SNP标记,探讨了四川康定县居群S1的分化问题.本工作可为藏药“解吉那保”种质资源保护、药材生药学鉴定及道地性探究等提供基础资料.

目的 研究粗茎秦艽Gentiana crasicaulis种子萌发的转录组信息及影响因子.方法 利用高通量测序技术测定粗茎秦艽种子萌发前、萌发中及萌发后3个阶段的转录组,并通过生物信息学技术进行分析.结果 共获得了149 463条Unigenes,平均长度为601.88 bp,其中79 412个Unigene获得注释.6943个基因差异表达,大部分表现为萌发后上调表达,其中5188个富集到GO条目中,1815个富集到KEGG通路中,大多参与光反应过程、细胞壁合成、脂质代谢及次生代谢中.单碱基到六碱基核苷酸的SSR重复类型均有检出,SSR发生频率为15.13％,出现频率为18.81％,平均每3199 bp就含有1个SSR位点,SSR重复类型丰富,数目较多.结论 粗茎秦艽种子萌发过程有大量调控基因参与,光照、激素为重要的调控因子,SSR专用标记的开发切实可靠,且为粗茎秦艽的次生代谢调控研究奠定了基础.