目的:通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒，探究其在小鼠体内的免疫效果。方法:采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα和HAα-6M2e制备成双层蛋白质纳米颗粒。通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪进行物理表征后评估其细胞毒性。免疫小鼠后采用ELISA方法进行特异性抗体效价测定，ELISPOT检测细胞免疫水平，CCK-8法检测脾细胞的增殖情况。结果:本研究成功制备了粒径为（130.03±2.96） nm的双层蛋白质纳米颗粒FljB-6M2e-△D2D3-HAα/ HAα-6M2e。免疫小鼠后产生的抗M2e-IgG抗体效价为1∶25 600，抗HAα-IgG抗体效价为1∶12 800，高于对照组小鼠，差异均具有统计学意义（ t=3.051和3.780， P=0.038和0.019）。与对照组相比，多肽刺激可以使小鼠脾细胞显著增殖[M2e刺激增殖率：（154.18±2.34）%，HAα刺激增殖率：（151.51±1.56）%]（ t=12.942和24.591， P均<0.001），并且诱导产生分泌更多IL-4和IFN-γ的淋巴细胞（M2e刺激： t=5.477和6.571， P=0.005和0.013；HAα刺激： t=9.239和7.671， P=0.001和0.013）。多种细胞因子的mRNA水平显著升高，IFN-γ和IL-4的转录水平均高于对照组（IFN-γ： t=13.253和20.847， P均<0.001；IL-4 ： t=6.032和4.824， P=0.004和0.009)。 结论:本研究所制备的双层蛋白质纳米颗粒可以刺激小鼠产生较高水平的体液和细胞免疫应答，为开发多表位流感通用疫苗提供了有效依据。

目的:从驱动蛋白18B(KIF18B)中寻找具有抗肿瘤免疫效应的细胞毒性T淋巴细胞表位。方法:通过癌症基因图谱数据库和免疫组织化学确认KIF18B的表达。利用免疫表位数据库、超基序法、分子操作环境鉴定表位。酶联免疫斑点法、流式细胞术、钙黄绿素释放试验、人源性肿瘤动物模型用于评价表位体内外抗肿瘤免疫活性。秩和检验分析非正态分布变量的组间差异，独立样本 t检验比较多次检测结果的组间差异。 结果:确证KIF18B为乳腺癌抗原，并筛选获得组织相容性抗原A2.1限制性KIF18B表位——KIF18B-P1。KIF18B-P1组CD8 + T细胞比例、干扰素-γ分泌水平、靶细胞杀伤率均显著高于阴性肽组[(23.98±1.07)%比(8.81±0.34)%， t＝-23.446， P<0.01]，其移植瘤体积明显小于阴性肽组[(0.54±0.11) cm 3比(0.71±0.09) cm 3， t＝5.279， P<0.01]，差异有统计学意义。 结论:KIF18B优势表位KIF18B-P1具有体内外抗肿瘤免疫效应。

目的:鉴定富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein-15，LRRC15)来源的优势细胞毒性T淋巴细胞(cytosolic T lymphocyte，CTL)表位肽，并验证其诱导CTL特异性抗乳腺癌免疫效应。方法:收集中国医科大学附属第一医院乳腺癌外科自2010年1月至2010年7月经手术病理证实的乳腺癌组织及正常组织各30例。利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库和免疫组化方法评估LRRC15在乳腺癌中表达情况。利用免疫表位数据库(Immune Epitope Database and Analysis Resource，IEDB)联合SYFPEITHI数据库预测LRRC15蛋白序列中HLA-A2.1限定性CTL表位肽。利用分子对接软件MOE、T2亲和力实验和荧光共聚焦技术确认候选CTL表位肽与HLA-A2.1分子亲和性。利用酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)以及流式细胞术检测CTL表位肽免疫活性。利用钙黄素和Dil标记乳腺癌细胞评价CTL表位肽诱导的杀伤效应。建立乳腺癌移植瘤模型进行免疫回输，在体内评估CTL表位肽诱导的抗肿瘤效应。结果:相比于正常组织，LRRC15 mRNA在乳腺癌组织中表达水平明显增高，组间差异有统计学意义[(4.00±1.57)比(1.31±0.72)， Z＝14.85， P <0.05]；LRRC15 mRNA表达与CD8 ＋T细胞浸润呈显著正相关性( r＝0.20， P<0.001)。LRRC15蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达，可作为乳腺癌潜在靶点。在筛选得到的3条候选CTL表位肽中，L2与HLA-A2.1分子具有最高亲和力(FI＝2.490)。与阴性肽组相比，L2能够明显提升CD8 ＋T细胞亚群比例(27.70%比45.50%)，L2负载的树突状细胞(dendritic cells，DCs)能够明显提升CD8 ＋T细胞分泌干扰素(interferon，IFN) -γ的水平(50.20%比74.90%)。在最高效靶比时，L2诱导的效应细胞对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的杀伤效应明显高于阴性肽对照组，组间差异有统计学意义[(19.30±2.20)%比(8.60±1.40)%， t ＝1.45， P <0.05]，但对乳腺上皮细胞MCF-10A无杀伤效应( P >0.05)。L2负载DCs诱导的CTL细胞对2例乳腺癌组织来源的原代肿瘤细胞表现出明显的杀伤效应，且杀伤效应随着效靶比增高而增加。与阴性肽相比，L2诱导的CTL效应细胞使小鼠移植瘤体积明显降低[(450±110)mm 3比(725±130 )mm 3， t ＝0.36， P <0.05]，生存时间明显延长[(35±4.5)d比(29.16±1.94)d，LogRank P ＝ 0.000 ]。 结论:LRRC15来源HLA-A2.1限定性CTL表位肽L2能够在体外有效的诱导CTL免疫应答反应，并发挥抗乳腺癌效应。

目的:检测来源于黏蛋白4(MUC4)的人白细胞抗原(HLA)-A2限制性表位肽免疫BALB/c小鼠后产生细胞免疫应答的水平,筛选出体内具有免疫原性的HLA-A2限制性表位肽.方法:将来源于MUC4的候选HLA-A2限制性表位肽、通用性Th表位和弗氏不完全佐剂联合应用皮下免疫BALB/c小鼠,用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠脾细胞表位肽特异性细胞免疫应答的水平,体内细胞毒实验活性检测候选肽诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的能力,并用流式细胞术检测表位肽特异性的CD8 +T细胞所占比例.结果:在检测的4个表位肽中,P2004-1Y9V诱导BALB/c小鼠产生的细胞免疫应答最强,细胞毒实验结果显示,P2004和P2004-1Y9V对CAPAN-2细胞均有一定的杀伤作用,且P2004-1Y9V特异性CTLs对CAPAN-2细胞杀伤率高于原肽(P<0.05).胞内因子染色实验进一步表明P2004-1Y9V免疫后可产生特异性的CD8 +T细胞.结论:在来源于MUC4的HLA-A2限制性表位肽中,P2004-1Y9V具有较强的体内免疫原性,可以作为潜在的肿瘤多肽疫苗应用于临床研究.

目的:观察肝癌高表达抗原MAGEC2的改造表位是否有HLA-A2限制性抗肿瘤能力.方法:通过NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB软件预测打分选取MAGEC2的HLA-A2限制性表位;替换MAGEC2抗原锚定位点氨基酸获得改造肽;结合力实验检测候选表位与T2细胞表面HLA-A2分子的结合能力,ELISPOT实验和胞内因子染色检测候选表位肽诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分泌干扰素γ(IFN-γ)的能力,体外细胞毒实验检测诱导CTL的能力.结果:P248、P248-1Y、P356、P356-1Y、P356-2L和P356-1Y2L具有较好的结合力,且P248-1Y和P356-1Y2L等改造肽与HLA-A2的结合力高于原肽.胞内因子染色和ELISPOT实验结果显示,表位肽P248、P248-1Y、P356和P356-1Y2L诱导的CTL具有分泌IFN-γ的能力,且P248-1Y和P356-1Y2L诱导特异性T细胞免疫分泌的IFN-γ略高于原肽(P<0.05).细胞毒实验结果显示表位肽P248、P248-1Y、P356和P356-1Y2L对HepG2细胞均有一定的杀伤作用,且P248-1Y和P356-1Y2L特异性CTLs对HepG2细胞杀伤率高于原肽特异性CTLs(P<0.05).结论:MAGEC2抗原改造表位P248-1Y和P356-1Y2L分别与天然表位P248和P356相比有更高的HLA-A2分子亲和力,保留了原有的免疫原性,并且改造肽抗肿瘤免疫效应强于天然表位.P248-1Y和P356-1Y2L是优秀的MAGEC2抗原的HLA-A2限制性CTL候选表位,可以成为新的抗肿瘤多肽免疫治疗疫苗的候选表位.

目的:预测并初步鉴定HLA-A3超型限制性MAGEC2抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位肽,为基于超型表位的MAGEC2治疗提供实验基础及新的候选靶标.方法:通过BIMAS、SYFPEITHI和IEDB软件预测打分来选取MAGEC2的HLA-A3限制性表位;结合力实验用于检测候选表位与T2A3细胞表面HLA-A3分子的结合能力,ELISPOT实验检测候选表位肽诱导的CTL分泌IFN-γ的能力,体外细胞毒实验检测侯选表位肽诱导的CTL杀伤靶细胞的能力.结果:表位肽P147、P167、P196、P229和P251具有较好的HLA-A3结合力.ELISPOT实验结果显示表位肽P167、P196和P251诱导的CTL具有分泌IFN-γ的能力.细胞毒实验结果显示表位肽P196和P251诱导的CTL对靶细胞有一定的杀伤作用(P<0.05或P<0.01).结论:P196和P251有更高的HLA-A3分子亲和力,保留了原有的免疫原性,是优秀的MAGEC2抗原的HLA-A3限制性CTL候选表位,可以成为新的抗肿瘤多肽免疫治疗疫苗的候选表位.

黑色素瘤相关抗原-D(MAGE-D) 基因位于X 染色体,具有MAGE 家族共有的同源结构域(MHD);MAGE-D 由4个成员组成,各成员的表达及功能各异;目前已发现一些成员表达于多种肿瘤组织,限制性表达于正常组织;其抗原肽可被特异性细胞毒性T 淋巴细胞识别,在体外诱导出抗肿瘤免疫效应,在一些肿瘤患者体内产生相应的抗体.MAGE-D 家族的一些成员有望成为胶质瘤免疫治疗的候选靶点.

[目的]探讨Toll样受体(TLR)配体多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(PIC)、非甲基化胞嘧啶嘌呤二核苷酸(CpG)对小鼠人乳头瘤状病毒(HPV)抗原肽-HPV11E7基因细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽的免疫调节作用.[方法]提取小鼠骨髓树突状细胞(BM-DC)(抗原递呈细胞)及脾细胞(效应细胞),BM-DC经体外培养后与HPV11E7 CTL表位肽孵育,分为PIC组(添加PIC)、CpG组(添加CpG)、肽组(不添加试剂)及对照组(不做任何处理).将肽和TLR配体处理后的BM-DC与脾细胞按1:17比例混合后低温保存备用.ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及干扰素-γ(IFN-γ).将培养7 d后的各组脾细胞培养液上清液(视为效应细胞)分别与表达HPV11E7基因的小鼠B16细胞(肿瘤细胞,视为靶细胞)按不同比例(200:1,100:1,50:1,25:1)均匀混合,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL杀伤活性.[结果]PIC组及CpG组TNF-α均明显高于肽组及对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);CpG组IFN-γ明显高于其他三组,差异具有统计学意义(P<0.05),PIC组、肽组、对照组比较差异无显著性(P>0.05).在效/靶细胞比例25:1时各组CTL杀伤率无显著差异(P>0.05),当随着效/靶细胞比例增加PIC组及CpG组CTL杀伤活性均呈明显增高(P<0.05),但当比例增加到100:1以上时PIC组及CpG组增长幅度降低,呈现缓增趋势(P>0.05).[结论]TLR配体激动剂PIC及CpG均有明显CTL杀伤效果,可上调小鼠HPV11E7 CTL表位肽的免疫应答而使TNF-α分泌上调,而CpG还可上调IFN-γ分泌,提示PIC及CpG对小鼠HPV11E7 CTL表位肽有免疫调节作用.

目的:设计针对肺癌抗原环加氧酶2(COX-2)的长肽,并鉴定这些长肽的免疫活性.方法:通过NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB软件预测打分来选取COX-2的HLA-A2限制性表位;对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位集中区域选取合适长度的长肽,通过体外活性实验验证长肽是否具有免疫活性.树突状细胞(DC)荷肽实验和ELISPOT检测荷长肽DC诱导的外周血单个核细胞(PBMCs)中干扰素γ(IFN-γ)的释放;胞内因子染色检测表位肽诱导CTL的能力;乳酸脱氢酶(LDH)实验和CFSE法检测CTL对靶细胞的杀伤活性.结果:ELISPOT和胞内因子染色实验结果显示,长肽P315-338和P375-401诱导的CTL具有分泌IFN-γ的能力.CFSE和LDH细胞毒实验结果显示表位P315-338和P375-401对靶细胞有一定的杀伤作用.结论:成功筛选并鉴定出针对肺癌抗原COX-2的2条长肽.这2条长肽具有用作免疫治疗疫苗的潜能.

目的 建立巨细胞病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CMV CTL) 体外扩增的方法.方法 用1μg/mL全长巨细胞病毒pp65 (CMV pp65) 多肽体外多轮刺激由粒细胞-集落刺激因子 (G-CSF) 动员的外周血干细胞采集物中分离的单个核细胞 (PBMC), 同时加入白细胞介素2 (IL-2) 、 IL-15、 IL-21扩增20 d.在培养第7天, 加入丝裂霉素处理的负载CMV pp65抗原肽的自体PBMC, 第10天补充经γ射线辐照处理并负载CMV pp65抗原肽的PBMC和CD3 (OKT3);对照组为未加入抗原肽进行扩增的PBMC组.采用多色流式细胞术分别对扩增前、扩增后的T淋巴细胞表型及细胞内肿瘤坏死因子α (TNF-α) 和γ干扰素 (IFN-γ) 的分泌水平进行分析, ELISA检测供者血清中CMV IgM/IgG抗体滴度水平.结果 培养后可以收集得到 (165.26±6.14) ×106个细胞, 其中CD3+ T细胞占89.21％, CD8+ T细胞占CD3+ T细胞的 (43.54±28.03) ％, CD4+ T细胞占CD3+ T细胞 (34.23±26.18) ％.获得的CD3+ T细胞以效应记忆性T细胞 (TEM) 为主, 且扩增培养后的CD8+和CD4+ TEM比例较培养前显著增高.另外, 培养后干细胞样记忆性T细胞 (TSCM) 和组织原位记忆T细胞 (TRM) 的比例均较培养前显著增加.在功能实验中, 培养后得到的IFN-γ+的分泌型CMV特异性CD8+ T细胞群比例较扩增前明显增加, TNF-α+ CMV特异性CD8+ T细胞比例呈增长趋势;能够分别分泌IFN-γ和TNF-α的CMV特异性CD4+ T细胞群比例与培养前无明显变化.此外, 供者体内CMV IgG水平与供者年龄呈现正相关, 且在该培养体系下, IFN-γ+和TNF-α+ CMV特异性T细胞扩增比例与供者年龄呈负相关.结论 本研究成功建立了在体外有效的培养和扩增CMV CTL的方法.