目的:通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒，探究其在小鼠体内的免疫效果。方法:采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα和HAα-6M2e制备成双层蛋白质纳米颗粒。通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪进行物理表征后评估其细胞毒性。免疫小鼠后采用ELISA方法进行特异性抗体效价测定，ELISPOT检测细胞免疫水平，CCK-8法检测脾细胞的增殖情况。结果:本研究成功制备了粒径为（130.03±2.96） nm的双层蛋白质纳米颗粒FljB-6M2e-△D2D3-HAα/ HAα-6M2e。免疫小鼠后产生的抗M2e-IgG抗体效价为1∶25 600，抗HAα-IgG抗体效价为1∶12 800，高于对照组小鼠，差异均具有统计学意义（ t=3.051和3.780， P=0.038和0.019）。与对照组相比，多肽刺激可以使小鼠脾细胞显著增殖[M2e刺激增殖率：（154.18±2.34）%，HAα刺激增殖率：（151.51±1.56）%]（ t=12.942和24.591， P均<0.001），并且诱导产生分泌更多IL-4和IFN-γ的淋巴细胞（M2e刺激： t=5.477和6.571， P=0.005和0.013；HAα刺激： t=9.239和7.671， P=0.001和0.013）。多种细胞因子的mRNA水平显著升高，IFN-γ和IL-4的转录水平均高于对照组（IFN-γ： t=13.253和20.847， P均<0.001；IL-4 ： t=6.032和4.824， P=0.004和0.009)。 结论:本研究所制备的双层蛋白质纳米颗粒可以刺激小鼠产生较高水平的体液和细胞免疫应答，为开发多表位流感通用疫苗提供了有效依据。

鞭毛是位于某些细菌菌体表面细长呈波状弯曲的具有运动功能的蛋白质附属丝状物，不仅在细菌的运动与致病能力中起到重要作用，而且参与宿主多种免疫调节。鞭毛蛋白(flagellin)是形成鞭毛细丝主要部分的结构蛋白，可以被宿主细胞的Toll样受体5(TLR5)等受体识别，诱导机体免疫应答。目前，鞭毛蛋白因其免疫激活作用被广泛应用于新型免疫佐剂的研究，而其炎症抑制作用也在对抗免疫病理损伤方面具有良好前景。本文将对鞭毛蛋白的基本结构功能、宿主识别机制及其对宿主免疫系统起到的调节作用的研究进展作一概述。

目的:以角鲨烯、山梨醇、吐温为组分,在琥珀酸缓冲液中混和甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白制备复合佐剂Nano-fla,评价该佐剂对人二倍体狂犬疫苗的免疫效果和安全性.方法:以人二倍体细胞制备的狂犬灭活疫苗为抗原,BALB/c小鼠设置PBS对照组、全剂量疫苗组、半剂量疫苗组、低剂量佐剂组(含半剂量抗原+5μg鞭毛蛋白)、中等剂量佐剂组(含半剂量抗原+10μg鞭毛蛋白),免疫程序为在0、3、7 d肌肉注射,并在首针免疫后的第7、14 d尾静脉采血分离血清,通过快速免疫荧光灶抑制实验检测中和抗体,通过酶联免疫斑点实验检测细胞因子水平.结果:首针免疫后第7 d,中等剂量佐剂组的中和抗体达保护效力水平,显著高于全剂量疫苗组和低剂量佐剂组;第14 d时中等剂量佐剂组的IgG抗体浓度显著高于全剂量疫苗对照组;第14 d中等剂量佐剂组与全剂量疫苗组相比,分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数量显著增加.结论:复合佐剂Nano-fla应用到狂犬疫苗中,能有效刺激小鼠体液免疫和细胞免疫应答,更早地产生中和抗体,且能有效降低抗原用量,具有潜在应用价值.

用调节性T细胞(Treg)表位肽进行免疫、激发和诱导表位肽特异的Treg细胞,抑制过强的自身免疫应答,从而建立起新的免疫稳态,是一个很有前景的自身免疫性风湿病的治疗方案,然而小分子的表位肽通常很难在体内有效激发出表位肽特异的免疫应答.细菌鞭毛蛋白是固有免疫系统的一种激动剂,在作为偶联载体时对偶联的抗原有极强的佐剂作用,在特定情况下能够激发和诱导Treg细胞.因此,如果将Treg细胞表位肽与细菌鞭毛蛋白共价偶联,偶联体应可通过鞭毛蛋白本身的作用,以及鞭毛蛋白对Treg细胞表位肽的佐剂作用,有效增强基于Treg细胞的免疫应答,从而增强对自身免疫性风湿病的免疫治疗效果.

细菌菌影(bacterial ghosts,BGs)是革兰阴性菌的细菌空壳,含有天然的免疫刺激剂(如脂多糖、鞭毛蛋白等),是固有免疫和适应性免疫细胞的强效激活剂.体内外试验研究表明,BGs具有免疫佐剂效应,能够诱导多种细胞产生前炎症细胞因子,后者可招募T细胞和B细胞聚集淋巴结,进而激活一系列体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫应答.本文总结了菌影作为疫苗佐剂的广泛应用及其诱导免疫应答的机制,以期为新型疫苗制剂的研制提供思路.

新型冠状病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球持续流行,疫苗的研发和推广使用是阻止新冠疫情的关键手段.SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)作为病毒的主要结构蛋白,是疫苗开发的潜在候选靶点.鞭毛素B(FlaB)可作为免疫佐剂,增强抗原的免疫原性.本研究对NP和NP-FlaB融合蛋白的免疫原性开展了研究,利用大肠杆菌表达系统分别表达纯化了NP、NP-FlaB融合蛋白,将抗原通过皮下或鼻内途径免疫BALB/c小鼠,分析血清中NP特异性免疫球蛋白G(IgG)、黏膜中NP特异性免疫球蛋白A(IgA)和NP特异性细胞因子分泌的T细胞应答.结果表明:一次皮下免疫NP或NP-FlaB融合蛋白足以引起抗NP的血清IgG抗体反应,能有效诱导分泌白细胞介素4(IL-4)的NP特异性效应T细胞,但NP和NP-FlaB融合蛋白组别之间无显著性差异;鼻内途径免疫下,NP-FlaB融合蛋白免疫组血清中NP特异性IgG抗体滴度和肺内黏膜IgA抗体滴度显著高于NP组.整体结果显示,SARS-CoV-2 NP和NP-FlaB融合蛋白具有很强的免疫原性,NP-FlaB融合蛋白能引起黏膜免疫应答,两者均可作为SARS-CoV-2疫苗的候选蛋白.SARS-CoV-2 NP及NP-FlaB融合蛋白的免疫原性的探究为后续新冠病毒NP疫苗开发提供了新的思路和参考.

[目的]幽门螺杆菌黏附素A (HpaA)是幽门螺杆菌疫苗的一种有希望的抗原.探索嵌合鞭毛蛋白(cFLN)和壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶包封对鼻递送抗原HpaA诱导的免疫应答增强的佐剂作用.[方法]通过将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的DO、D1结构域与幽门螺杆菌鞭毛FlaA的D2、D3结构域相结合,构建嵌合鞭毛蛋白cFLN.作为分子内佐剂,嵌合鞭毛蛋白cFLN与黏附素(HpaA)连接构建复合抗原cFLN-HpaA.cFLN、HpaA、cFLN-HpaA在重组大肠杆菌中表达,并通过Ni-NTA预装色谱柱进行纯化.使用离子凝胶法分别将cFLN、HpaA、cFLN-HpaA包封到壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶中.[结果]成功表达和纯化了cFLN、HpaA和cFLN-HpaA,并用离子凝胶法将这3种抗原包封在CS/TPP/纳米凝胶中,制备了包封cFLN的CS/TPP纳米凝胶(cFLN-HpaA NG)、包封HpaA的CS/TPP纳米凝胶(HpaA NG)、包封cFLN-HpaA的CS/TPP/纳米凝胶(cFLN-HpaA NG).经鼻免疫小鼠后,与HpaA相比,cFLN-HpaA分别导致血清中IgG、IgG1和IgA含量增加2.09倍、1.4倍和2.62倍.与cFLN、HpaA和cFLN-HpaA相比,cFLN NG、HpaA NG和cFLN-HpaA NG分别使血清中IgA、IgG、IgG1和IgG2a的含量增加了1.28至1.71倍.[结论]cFLN和CS/TPP NG可以显著增强鼻腔输送的HpaA诱导的体液免疫.通过检测鼻腔免疫后胃黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17和SIgA的含量,与HpaA相比,cFLN-HpaA分别诱导IFN-γ、 IL-4和SIgA的含量增加1.38、1.16和1.58倍.与cFLN-HpaA相比,cFLN-HpaA NG分别使小鼠胃黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17和SIgA的含量增加1.81、1.71、2.16和2.1倍.表明cFLN和CS/TPP NG可以显著增强Th1和Th17型免疫应答.小鼠体内免疫原性研究表明,分子内佐剂cFLN和纳米凝胶包封不仅可以有效增强鼻腔输送HpaA诱导的体液免疫应答,而且还可以增强小鼠胃黏膜中的黏膜免疫应答—Th1和Th17型免疫应答.因此,这些结果表明,cFLN-HpaA NG可能是有希望的经鼻输送的用于预防幽门螺杆菌感染的疫苗系统.

目的 分析益生菌大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)鞭毛蛋白(FliC)的结构,并预测其B和T细胞表位.方法 从GenBank数据库中获取EcN FliC的氨基酸序列.应用ProtParam在线工具分析EcN FliC理化特性,Protscale在线工具分析亲疏水性,PSIPRED软件及DNAstar软件预测分析二级结构,I-TASSER在线软件预测三级结构,DNAstar在线工具中Protean软件和ABCpred软件综合预测B细胞抗原优势表位,细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,CTL)表位预测网站预测T细胞表位.结果 EcN FliC的相对分子质量为60 937.57,化学分子式为C2584H4201N745O940S6,不稳定指数为15.23;亲水性平均值为-0.324,为亲水性蛋白;α螺旋及无规则卷曲是EcN FliC二级结构中的主要结构;预测的三级结构模型具有正确的结构拓扑,可信度高;共筛选出13个B细胞优势表位及3个CTL优势表位.结论 EcN FliC特征分析及表位预测结果为其作为免疫佐剂的应用奠定了基础.

疫苗接种是预防传染病最为有效的措施.鉴于大多数病原主要通过黏膜途径感染机体,预先在黏膜表面建立有效的免疫应答是预防病原入侵的最佳方式.鼻腔免疫是一种高效、无痛的黏膜免疫途径,既可诱导系统免疫应答,又能诱导广泛的黏膜免疫应答.然而,大多数疫苗尤其是亚单位疫苗经鼻腔接种后难以诱导有效的黏膜免疫应答,需要借助佐剂的辅助作用.佐剂是一种非特异性免疫增强剂,通过激活天然免疫来增强适应性免疫应答从而达到提高疫苗保护效力的目的,是疫苗尤其是亚单位疫苗的重要组成部分.鞭毛蛋白作为鼻腔黏膜免疫佐剂的效应已被广泛证实:在增强系统免疫应答的同时,还能增强黏膜应答,尤其是分泌型IgA的产生.该文就鞭毛蛋白的分子结构、诱导的信号通路、作为疫苗佐剂的应用及机制方面的研究进展作一综述.

疫苗在传染性疾病预防控制中发挥重要作用.细菌鞭毛蛋白能激活宿主细胞Toll样受体5(Tolllike receptor5,TLR5)和NOD样受体C4(NOD like receptor C4,NLRC4),具有免疫佐剂效应.作为新型免疫佐剂,鞭毛蛋白既能与抗原蛋白共同作用,又能与抗原蛋白融合表达,均能显著提高免疫效果;同时,其在黏膜免疫和抗肿瘤免疫中也取得较好的应用效果,成为疫苗佐剂研发的热点.本文主要就细菌鞭毛蛋白作为疫苗佐剂应用的研究进展作一综述,以期为鞭毛蛋白佐剂疫苗的研发提供新思路.