目的 了解6-姜酚对骨关节炎软骨细胞凋亡及软骨降解的影响及其具体机制.方法 筛选出可显著上调USP49表达的中药活性成分(6-姜酚)并进行分子对接.随后,使用不同浓度的6-姜酚处理白细胞介素-1β(IL-1 β)诱导的软骨细胞,检测软骨细胞凋亡与泛素特异性蛋白酶49(ubiquitin specific pro-teases 49,USP49)、β-catenin 及软骨降解相关蛋白[基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)]的表达.结果 经过筛选,发现6-姜酚可显著促进USP49表达,分子对接显示6-姜酚与USP49可高效结合.不同浓度的6-姜酚处理IL-1β诱导的软骨细胞后,可显著上调USP49表达,抑制细胞凋亡及β-catenin、MMP-1与MMP-13表达.结论 6-姜酚通过上调USP49表达调控Wnt/β-catenin信号转导通路,抑制软骨细胞凋亡及软骨降解相关蛋白MMP-1,MMP-13的表达,进而缓解IL-1β诱导的软骨退行性改变.

目的 研究泛素特异性蛋白酶49(USP49)和FK506结合蛋白51(FKBP51)在糖尿病神经病理性痛(DNP)大鼠脊髓背角中的表达及作用. 方法 SD雄性大鼠通过高糖高脂饮食饲养和腹腔注射1％链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型并按照随机数字表法分为DNP组、对照短发夹RNA(shRNA)组和USP49沉默组,每组10只.3组大鼠分别鞘内注射生理盐水、Ad-scrambledshRNA(3×108 PFU/mL)、Ad-USP49-shRNA(3× 108 PFU/mL).另取10只正常大鼠作为对照组,不做任何处理.分别于造模前1d、造模后1d、7d、鞘内注射后1、3、7d测定大鼠热缩足潜伏期(TWL)和机械缩足反应阈(MWT),并检测背角神经元USP49、FKBP51、糖皮质激素受体α(GRα)mRNA和蛋白的表达水平. 结果 (1)造模前1d,4组大鼠TWL差异无统计学意义(P＞0.05).鞘内注射后3d、7d,USP49沉默组TWL明显长于DNP组,短于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).(2)造模前1d,4组大鼠MWT差异无统计学意义(P＞0.05).鞘内注射3d、7d后,USP49沉默组MWT明显高于DNP组,低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)与DNP组比较,USP49沉默组USP49mRNA、FKBP51 mRNA表达显著下降,GRα mRNA表达显著上升,差异有统计学意义(P＜0.05).(4)与DNP组比较,USP49沉默组USP49蛋白、FKBP51蛋白表达明显降低,GRα蛋白明显上升,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 特异性沉默脊髓背角神经元USP49表达可改善DNP大鼠热痛敏反应和机械痛敏反应,其机制可能与USP49介导的FKBP51蛋白去泛素化有关.

目的 探究刚地弓形虫不同毒力虫株感染后宿主细胞泛素化蛋白谱变化的特点.方法 将人外周血单核细胞诱导成巨噬细胞后分为3组,分别为未感染组、RH感染组、ME49感染组.2个感染组分别用弓形虫不同毒力株(RH株与ME49株)速殖子感染4h后,收集3组细胞的总蛋白,应用泛素抗体富集泛素化蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白后进行蛋白定性质谱鉴定.检测完成后,搜索UniProt数据库中的人类数据库,利用Mascot鉴定蛋白质种类.蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析蛋白CDC42的泛素化水平.利用DAVID数据库对感染组与对照组、不同毒力株感染组之间的显著差异性泛素化蛋白(DUP)进行基因本体(GO)注释和富集分析,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)在线网站对DUP进行信号通路富集分析,利用STRING 11.0在线网站对DUP进行蛋白-蛋白相互作用网络分析.结果 质谱筛选结果显示,RH感染组的特异性泛素化蛋白有194种,ME49感染组的有47种,两个感染组均筛选到的宿主泛素化蛋白有31种.Western blotting检测结果显示,宿主CDC42在弓形虫感染后泛素化水平显著升高.GO聚类分析显示,细胞组分聚类中,RH感染组的DUP主要涉及能量代谢以及蛋白质合成、加工的细胞器,有67个蛋白;ME49感染组的DUP则主要涉及细胞骨架结构,有11个蛋白;在生物进程聚类中两组差异不大,不同的是,ME49感染组的DUP富集到肝配蛋白受体信号通路(3个)和网格蛋白介导的内吞作用蛋白(2个);在分子功能聚类中,RH感染组的DUP主要富集在与RNA转录/加工、GTPase活性、泛素连接酶相关的聚类项,分别有47、7和11个蛋白;ME49感染组的DUP则主要富集在肌动蛋白丝结合(3个)等GO项上.KEGG信号通路富集显示,RH感染组的DUP主要富集在核糖体(12个)、泛素介导的蛋白水解(8个)、吞噬体(7个)、核苷酸切除修复(4个)、致病性大肠埃希菌感染(4个)等通路;ME49感染组的DUP则富集在核糖体(3个)、肌动蛋白细胞骨架调节(3个)和致病性大肠埃希菌感染(2个)的通路上.RH感染组DUP相互作用网络图主要的节点蛋白包括60S核糖体蛋白L9、蛋白质转运蛋白SEC61亚单位α亚型1以及RAS相关C3肉毒毒素底物1等.RH感染组与ME49感染组共有泛素化蛋白的相互作用网络图主要节点蛋白则有核糖体蛋白以及细胞分裂周期蛋白42等.结论 弓形虫感染引起宿主细胞的泛素化蛋白谱发生显著变化,与感染虫株的毒力相关;DUP包括细胞骨架、核糖体、泛素蛋白酶体途径的主要蛋白.

目的 了解USP49对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及细胞外基质降解的影响.方法 首先基于数据库了解USP49在骨关节炎患者中的表达水平.原代培养软骨细胞并鉴定,使用不同浓度的IL-1β预处理软骨细胞,检测USP49基因表达与蛋白水平后,选择合适的IL-1β浓度模拟骨关节炎.使用IL-1β 处理构建的USP49过表达软骨细胞,检测软骨细胞凋亡,测定USP49、β-catenin及软骨降解相关蛋白MMP-1、MMP-13表达.结果 较正常人样本,USP49在骨性关节炎患者中表达显著降低.原代软骨细胞经不同浓度IL-1β预处理后,USP49表达明显抑制,且随浓度增加,抑制作用增强.USP49过表达可显著减弱IL-1β诱导的细胞凋亡,抑制 β-catenin、MMP-1、MMP-13表达.结论 USP49可能通过Wnt/β-catenin通路抑制软骨细胞凋亡及细胞外基质降解,减轻IL-1β诱导的软骨退变.