寄生虫病仍然是全球最大的健康问题，给贫困地区造成巨大的经济负担。目前用于治疗原虫病和蠕虫病的药物存在一定缺陷，亟待研发更为有效的治疗药物。小檗碱最早从黄连的根茎中提取获得，是一类重要的抗炎药物。小檗碱的衍生物通过修饰小檗碱的结构位点获得，除了具有抗菌和抗微生物活性以外，小檗碱及其衍生物还具有显著的抗寄生虫活性。本文概括了小檗碱及其衍生物抗原虫（利什曼原虫、锥虫、刚地弓形虫、恶性疟原虫和柔嫩艾美尔球虫）和蠕虫（曼氏血吸虫、日本血吸虫、细粒棘球绦虫和犬弓首蛔虫）感染的作用，以期为相关研究工作者提供参考。

目的:了解获得性免疫缺陷综合征（AIDS）合并感染性葡萄膜炎患者眼内液病原微生物分布情况。方法:回顾性病例研究。2018年6月至2019年12月于上海市公共卫生临床中心住院或门诊就诊的AIDS合并感染性葡萄膜炎患者31例纳入研究。其中，男性30例，女性1例；平均年龄（38.51±11.17 ）岁。全葡萄膜炎20例，后葡萄膜炎10例，感染性眼内炎1例。同期血清CD4 +T淋巴细胞计数（CD4 +TC）0~239个/μl。采用二代基因测序技术对采集的眼内液进行检测。31份标本中，房水、玻璃体液分别为27、4份。 结果:31份标本中，检测到巨细胞病毒（CMV）18份（58.1%，18/31 ）；水痘-带状疱疹病毒（VZV）5份（16.1%，5/31）；Epstein-Barr病毒（EBV）9份（29.0%，9/31 ）；人类β疱疹病毒6型（HHV6）3份（9.7%，3/31 ），人乳头状软疣病毒（HPV ）、人多瘤病毒、庚型肝炎病毒各1份（3.2%，1/31 ），均与其他微生物共存；细环病毒8份（25.8%，8/31 ）；梅毒螺旋体5份（16.1%，5/31 ）；刚地弓形虫和哈蒙哈蒙球虫1份（3.2%，1/31）；Synitelium Polycarpum 1份（3.2%，1/31 ）；结核分支杆菌复合群、真菌、微杆菌共存1份（3.2%，1/31）。CMV 18份标本中，基因序列数>10 5 9份（50.0%），10 4～10 5 5份（27.7%）。VZV 5份标本中，基因序列数>10 4 4份（80.0% ）。结核分支杆菌复合群、真菌、微杆菌共存的1份标本，基因序列数均<100。所有标本中读取到的HHV6、HPV、人多瘤病毒、庚型炎病毒、细环病毒基因序列数均较低。31份标本中，检测到病原微生物≥2种15份（48.4% ）。 结论:CMV、VZV是血清CD4 +TC <100个/μl AIDS患者感染性葡萄膜炎的主要致病微生物；梅毒螺旋体、刚地弓形虫或其他原虫、结核杆菌、真菌引起的感染性葡萄膜炎更常见于血清CD4 +TC>100个/μl的AIDS患者。合并感染性葡萄膜炎的AIDS患者眼内液中可检测到2种或以上微生物共存。

目的:分析深圳市免费孕前优生健康检查育龄女性的TORCH筛查结果，以期指导科学备孕。方法:对2013年1月至2019年12月期间参加深圳市免费孕前优生健康检查的330 115例育龄女性的TORCH筛查结果进行横断面研究，通过 χ2检验分析TORCH筛查结果在不同年份、不同行政区域以及不同人口学特征育龄女性间的差异。 结果:深圳市育龄女性风疹病毒（rubella virus，RV）-IgG、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）-IgG、CMV-IgM、刚地弓形虫（toxoplasma，TOX）-IgG、TOX-IgM筛查总体阳性率分别为85.54%（282 377/330 115）、96.36%（318 088/330 115）、0.31%（1009/330 115）、3.12%（10 292/330 115）、0.64%（2114/330 115），2017年至2019年较2013年至2016年育龄女性RV-IgG、CMV-IgG平均阳性率升高（ P=0.003， P<0.001），TOX-IgG、TOX-IgM平均阳性率降低（ P<0.001）。五种抗体阳性率在不同行政区域间的差异均有统计学意义（ P均<0.001）。除CMV-IgM、TOX-IgM阳性率在不同年龄女性间的差异无统计学意义外，五种抗体阳性率在其他人口学特征育龄女性间的差异均有统计学意义（ P均<0.05）。不同人口学特征女性在不同年份TORCH抗体阳性率的变化差异有统计学意义。 结论:与2013年至2016年相比，2017年至2019年深圳市育龄女性RV-IgG、CMV-IgG阳性率有所升高，TOX-IgG、TOX-IgM阳性率有所下降。五种抗体阳性率在各区之间、不同人口学特征育龄女性间存在差异，提示在优生优育宣教时要因地制宜、因人而异地定改成订，强化优生意识，降低胎儿先天性宫内感染TORCH的风险。

建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)检测利什曼原虫的方法,为内脏利什曼病防治提供技术支持.根据利什曼原虫动基体5.8S核糖体RNA(GenBank:OP829811)序列,设计合成LAMP扩增特异性引物,建立LAMP法.用LAMP法检测恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫感染者和健康人血样DNA,以及日本血吸虫、刚地弓形虫和杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA,评价LAMP法的特异性评价特异性;杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA稀释为 1 ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1 pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1 fg/μl,确定LAMP法的最低检测限及有、无钙黄绿素对检测限的影响.用建立的LAMP法和实时荧光定量PCR(qPCR)检测不明原因发热患者和健康人血样;取阳性患者骨髓涂片吉氏染色后镜检,查找利什曼原虫无鞭毛体.建立的LAMP法可检出杜氏利什曼原虫DNA,反应结果呈绿色;检测4种疟原虫感染者和健康人血样以及日本血吸虫、刚地弓形虫DNA的结果均为阴性,呈橙色.LAMP法检测健康人血样46份,均呈阴性,无交叉反应,特异性高.65 ℃反应60min,未加和加钙黄绿素的检出限分别为1pg/μl和1 ng/μl,浊度速率峰值均值分别为0.194、0.120,加钙黄绿素后出现浊度时间较未加钙黄绿素平均延迟23.6 min.LAMP法和qPCR法检测发热患者血样67份的结果一致,均检出相同的2份阳性,2份阳性血样对应的骨髓涂片镜检均查见利什曼原虫无鞭毛体.本研究建立的了检测利什曼原虫的LAMP法操作简便、灵敏度和特异性均较高,检测结果可视,具有较好的推广应用价值.

目的 分析刚地弓形虫感染对小鼠脑组织转录本的N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修饰水平的影响.方法 20只雌性C57BU6J小鼠随机分为TgCtwh6感染组(7只)、LHG感染组(7只)和对照组(TgCtwh6感染组、LHG感染组的对照各3只).TgCtwh6感染组、LHG感染组分别灌胃接种中国Ⅰ型wh6株(TgCtwh6)和中国Ⅲ型LHG株刚地弓形虫感染小鼠脑组织悬液0.2 ml(20个包囊/鼠),对照组灌胃等量的生理盐水.分别在接种后15、30和45 d,用抽签法随机抽取感染组小鼠各1只,麻醉后处死,取脑组织,于显微镜下分别记录大脑皮层区、海马区和嗅球区的包囊数.感染后45 d每组分别取3只小鼠的全脑组织,提取总RNA,制备基因组文库,进行转录组测序,筛选差异甲基化位点(DML),统计感染组和对照组的mRNA的差异m6A甲基化位点及其所在转录本;对甲基化位点所在转录本进行基因本体功能注释(GO)分析,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,对甲基化差异转录本进行基因集富集分析(GSEA).选取甲基转移酶样3(METTL3)、肥胖相关蛋白(FTO)和YTH结构域3(YTHDF3)等3种m6A甲基化修饰蛋白基因,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为内参,实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测其相对转录水平.结果 感染组小鼠均感染成功.感染后45 d,大脑皮层、海马和嗅球的包囊数分别为(5 676±10)、(4 773±9)、(243±10)个.感染组和对照组共检出760 650个甲基化位点,其中GGACA、GGACC、GGACT、ACGAT等4种 m6A模体的甲基化水平分别占 16.8％(127 923/760 650)、4.6％(35 164/760 650)、3.8％(28 983/760 650)和0.4％(3 122/760 650);共检出高甲基化位点所在转录本127 016条,其中GGACA、GGACC、GGACT和ACGAT所在的转录本分别为71 727、27 754、24 556和2 979条.感染组与对照组小鼠脑组织转录组中ACGAT、GGACA、GGACC、GGACT等4种m6A模体的DML位点总数为9 233,其中高甲基化位点4 832个,低甲基化位点4 851个.GO分析结果显示,DML所在转录本显著富集于生物过程中的细胞过程、细胞组分中的细胞和分子功能中的结合等功能.DML所在转录本的KEGG富集分析结果显示,分子间相互作用网络主要富集在溶酶体、剪接体和多巴胺能突触信号通路等途径中.对生物过程的GO富集分析结果显示,DML所在的转录本中,生物过程相关的部分转录本主要富集于蛋白糖基化、神经元凋亡负调控、蛋白质的入核转运等过程.GSEA分析结果显示,对照组和两个感染组的组间差异甲基化高分富集于成纤维细胞增殖负调控通路和Hippo信号通路相关的转录本子集中,其中筛选出 ENSMUST00000105393、ENSMUST00000006523、ENSMUST00000055261和ENSMUST00000038658等4个关键转录本,分别编码共刺激因子配体(ICOSL)、富含半胱氨酸肠蛋白1(CRIP1)、MOB激酶激活剂1A201(MOB1A201)和MOB1A202,与对照组相比,TgCtwh6感染组、LHG感染组的这4个基因表达均上调.qRT-PCR结果显示,TgCtwh6感染组、LHG感染组小鼠脑组织mettl3mRNA相对表达水平分别为5.47±1.09、1.63±0.06,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=4.05、5.03,均P＜0.05);ythdf3 mRNA相对表达水平分别为3.57±0.08、1.80±0.25,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=18.95、2.85,均 P＜0.05);fto mRNA 相对表达水平分别为 0.41±0.04、0.60±0.12,与对照组(1.00±0.06)比较差异有统计学意义(t=7.67、2.99,均P＜0.05);qRT-PCR结果与转录组测序获得的转录趋势一致.结论 弓形虫慢性感染可导致小鼠脑组织转录本m6A甲基化修饰水平升高,并可能通过对icosl、crip1和mob1a等关键差异转录本的修饰调控,造成宿主脑组织内与精神行为相关的生物学进程和信号通路的改变.

目的 探究孕鼠胎盘中性粒细胞和炎性因子白细胞介素17(IL-17)在孕期刚地弓形虫(简称弓形虫)感染致不良妊娠结局中的作用机制.方法 将C57BU6孕鼠随机分为未感染组和感染组(每组6只),感染组孕鼠在孕8 d腹腔注射0.2 ml弓形虫RH株速殖子悬液(约400个速殖子),未感染组孕鼠腹腔注射等量灭菌PBS.于孕14d采用颈椎脱臼法处死孕鼠,解剖观察并记录妊娠结局.取胎盘组织,制备石蜡切片,经苏木苏-伊红(HE)染色后观察胎盘组织学改变和多形核粒细胞的浸润情况,并计算浸润指数.制备胎盘组织单细胞悬液,采用流式细胞术检测胎盘免疫细胞中中性粒细胞.采用免疫组织化学染色检测胎盘组织中弓形虫的分布、定位及IL-17的表达水平(灰度值),采用Spearman相关性分析方法分析IL-17的表达水平与中性粒细胞浸润指数的关系.两组间数据比较采用独立样本Student's t检验.结果 感染组孕鼠出现弓背、耸毛和行动迟缓等症状,胎鼠和胎盘出现明显出血及淤血点,胎鼠发育不良;未感染组孕鼠无异常表现,胎鼠和胎盘发育正常.感染组孕鼠的流产率为82.35％(42/51),高于未感染组的4.08％(2/49).HE染色结果显示,感染组孕鼠胎盘组织细胞轮廓性增强,并伴有大量的多形核粒细胞浸润,浸润指数为14.500±0.965,高于未感染组的3.917±0.633(t=9.168,P＜0.01).流式细胞术结果显示,感染组孕鼠胎盘组织中中性粒细胞占胎盘细胞的绝对百分数为(13.700±1.790)％,高于未感染组孕鼠的(4.783±0.723)％(t=5.107,P＜0.01).免疫组织化学染色结果显示,感染组孕鼠胎盘组织中检测到大量弓形虫,并且主要集中分布于中性粒细胞内;感染组孕鼠胎盘组织中IL-17的灰度值为17.510±1.372,高于未感染组孕鼠的8.178±1.293(t=4.951,P＜0.05).相关性分析结果显示,孕鼠胎盘组织中IL-17的表达水平与中性粒细胞的浸润指数呈正相关(R2=0.652,P＜0.01).结论 刚地弓形虫感染可导致孕鼠胎盘组织出现大量中性粒细胞浸润和高水平IL-17的表达,IL-17表达水平的升高可能与中性粒细胞在母胎界面的募集有关.

刚地弓形虫是一种在世界范围内广泛分布的专性细胞内寄生原虫,可引起人兽共患弓形虫病.脑内弓形虫感染可导致中枢神经系统病变,引起抑郁症、精神分裂症、癫痫等症状.本文就弓形虫通过血脑屏障建立慢性感染,引起中枢神经系统损伤和脑部疾病的机制进行综述.

目的 研究刚地弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和膜表面抗原30(P30)复合核酸疫苗的免疫保护作用.方法 PCR扩增弓形虫p30和rop18基因,构建pVAX1-p30、pVAX1-rop18-p30质粒并进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定.用LipofectamineTM 3000转染试剂将pVAX1(2μg)和pVAX1-rop18-p30质粒转染至HeLa细胞内,24 h后间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达情况.75只雌性BALB/c小鼠随机分为pVAX1-rop18-p30组、pVAX1-rop18组、pVAX1-p30组、pVAX1组和PBS组,每组15只,分别于股四头肌注射100 μg(100 μl)的pVAX1-rop18-p30、pVAX1-rop18(本实验室保存)、pVAX1-p30、pVAX1 质粒或 PBS(100μl),共免疫 3 次,间隔 2 周,末次免疫时质粒剂量为200 μg.每次免疫前和末次免疫后2周采集小鼠血样,ELISA检测血清IgG抗体水平.末次免疫后2周每组取3只小鼠,无菌取脾细胞,培养后ELISA检测培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-10、IL-12的水平.末次免疫后2周,每组取12只小鼠,每鼠腹腔注射1 000个弓形虫RH株速殖子进行急性感染,记录小鼠存活时间,评价免疫保护性.组间比较采用单因素方差分析.结果 弓形虫p30和rop18基因PCR扩增片段分别为789、1 665 bp.pVAX1-rop18-p30质粒经PCR、酶切鉴定均获得预期大小的条带,测序鉴定结果正确.pVAX1-rop18-p30转染HeLa细胞后,胞质内可见黄绿色荧光,pVAX1转染的HeLa细胞内无黄绿色荧光.ELISA检测结果显示,末次免疫后2周,pVAX1-rop18-p30组吸光度(A450值)为0.788±0.025,高于pVAX1-rop18组(0.512±0.027)、pVAX1-p30组(0.498±0.027)、pVAX1 组(0.122±0.014)和 PBS组(0.109±0.011)(F=77.6,P＜0.05),pVAX1-rop18组和pVAX1-p30组之间A45.值差异无统计学意义(F=67.80,P＞0.05);小鼠血清IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间延长而升高.末次免疫后2周,pVAX1-rop18-p30组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 和 IL-12 的水平分别为(678.77±3.69)、(375.28±2.65)、(130.82±4.72)、(279.68±3.67)和(579.68±3.67)pg/ml,pVAX1-rop18组分别为(448.59±6.52)、(256.34±5.58)、(126.28±7.48)、(156.58±4.59)和(231.50±3.21)pg/ml;pVAX1-p30组分别为(423.67±4.82)、(277.92±4.23)、(115.17±4.37)、(137.18± 5.62)和(190.47±4.18)pg/ml,pVAX1 组分别为(48.97±2.65)、(47.65±2.76)、(47.14±2.04)、(45.29±2.31)和(46.21±2.17)pg/ml;PBS组分别为(47.69±3.42)、(46.77±3.35)、(48.59±4.75)、(44.92±4.91)和(46.88± 3.56)pg/ml.pVAX1-rop18-p30 组、pVAX1-rop18 组和 pVAX1-p30组的 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 水平均高于pVAX1 组和 PBS 组(F=1 582.0、531.5、268.7、215.0、170.5,均 P＜0.05);pVAX1-rop18-p30 组的 IFN-γ、IL-10、IL-12 水平均高于 pVAX1-rop18和 pVAX1-p30 组(F=1 620.8、1 208.0、728.0,均 P＜0.05);pVAX1-rop18-p30 组、pVAX1-rop18组和pVAX1-p30组间的IL-2和IL-4水平差异无统计学意义(F=53.21,P＞0.05).弓形虫急性感染后,pVAX1-rop18-p30 组、pVAX1-rop18 组、pVAX1-p30 组、pVAX1 组和 PBS 组小鼠平均存活时间分别为(288±2)、(196±3)、(230±6)、(144±2)和(146±11)h.pVAX1-rop18-p3 0 组、pVAX1-rop18 组和 pVAX1-p30 组小鼠平均存活时间长于 pVAX1 组和 PBS组(F=100.1,P＜0.05);pVAX1-rop18-p30组长于 pVAX1-rop18组和 pVAX1-p30组(F=38.7,P＜0.05)结论pVAX1-rop18-p30复合核酸疫苗能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染的免疫保护效果优于pVAX1-rop18和pVAX1-p30单基因核酸疫苗.

弓形虫子孢子表面抗原(SporoSAG)和棒状体蛋白 5(ROP5)是不同阶段虫体表面的特异性抗原,与弓形虫分化及入侵宿主细胞密切相关.本研究表达并纯化重组蛋白rSporoSAG与rROP5,将重组蛋白通过单独、联合等不同方式分别免疫Balb/c小鼠,检测小鼠体液和细胞免疫水平.结果显示rSporoSAG 和rROP5 成功表达,大小分别约为 49.4 和 38.2 kDa.小鼠免疫实验中,rSporoSAG组、rROP5 组、rSporoSAG +rROP5 组、初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5 组总IgG、IgG1、IgG2a水平与对照组相比显著升高(P<0.05),其中,初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5 组的总IgG和IgG2a水平最高.细胞因子检测显示初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5 组IL-2 水平与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),其他组IL-2 水平与对照组相比无显著差异(P>0.05).各实验组IL-4、IFN-γ水平与对照组相比无显著差异(P>0.05).淋巴细胞增殖实验结果显示各实验组与对照组间均无显著差异(P>0.05).结果表明,本实验成功表达rSporoSAG、rROP5.rSporoSAG、rROP5 单独或联合等免疫Balb/c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫,但不能有效激活细胞免疫应答,仅初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5 组IL-2 水平与对照组具有显著性差异,提示先免疫rSporoSAG再免疫rROP5 蛋白的免疫策略与其他免疫策略相比是一种更有效的方法,可用于预防弓形虫卵囊感染的研究.

目的 探讨蒿甲醚脂质体(ARM-Lip)体外抑制刚地弓形虫(简称弓形虫)速殖子增殖的作用.方法 将含有1× 104个人宫颈癌细胞置于96孔平底细胞培养板中培养,每孔100μl,设置不同浓度的ARM-Lip组(3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000、200.000、400.000和 800.000 μmol/L),对照组(仅含 1 × 104个人宫颈癌细胞)和空白组(仅含培养液),24h后ARM-Lip组每孔分别加入对应药物100μl,48h后各孔均加入10μl CCK-8溶液,1 h后使用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度(A值),计算细胞存活率和ARM-Lip的半数抑制浓度(IC50).进一步采用稳定表达绿色荧光的RH株(RH-GFP)弓形虫速殖子感染人宫颈癌细胞,与不同浓度的ARM-Lip进行共培育,筛选细胞存活率大于50％的安全浓度的ARM-Lip组,同时设置浓度为400 μmol/L的磺胺嘧啶(SDZ)组和未加药组.荧光显微镜观察24、48和72h后速殖子的增殖情况,测量共培养48 h时各组平均荧光灰度值,选取最佳浓度ARM-Lip组.吉氏染色后,光学显微镜下观察各组细胞内的纳虫空泡和弓形虫速殖子的生长情况并计数.组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异法检验.结果 ARM-Lip在25 μmol/L或以下浓度对人宫颈癌细胞几乎无毒性,IC50为 285.1 μmol/L.经 100.000、200.000、400.000和800.000 μmol/L 的 ARM-Lip 处理后,平均细胞存活率分别为 89.03％、76.30％、42.12％和 27.85％,选取 6.250、12.500、25.000、50.000 和100.000 μmol/L等5个浓度进行后续实验.荧光显微镜下可见未加药组弓形虫RH-GFP株速殖子大量增殖,形态正常,呈现高强度的绿色荧光;随着ARM-Lip浓度的增加,绿色荧光强度逐渐减弱.ARM-Lip体外抑制弓形虫繁殖的最佳作用浓度为100.000 μmol/L,最佳作用时间为48 h.未加药组、ARM-Lip组(100.000 μmol/L)和SDZ组作用48h 后,荧光灰度值分别为 89.92±1.12、35.74±1.55 和 7.34±0.60(F=7 916.301,P＜0.01),ARM-Lip 组和 SDZ组的平均灰度值相比未加药组均下降(t=81.247、123.831,均P＜0.01),SDZ组低于ARM-Lip组(t=-42.584,P＜0.01).经吉氏染色,未加药组、ARM-Lip组和SDZ组的纳虫空泡数分别为(28.667±2.658)、(16.667± 0.817)和(12.667±1.211)个(F=135.652,P＜0.01),弓形虫 RH-GFP株速殖子数分别为(176.167±13.273)、(105.333±7.789)和(70.167±5.947)个(F=192.763,P＜0.01),ARM-Lip组和 SDZ组纳虫空泡数量相比未加药组均减少(t=0.083、0.063,均P＜0.01),弓形虫RH-GFP株速殖子数量也减少(t=0.014、0.009,均P＜0.01),SDZ组的纳虫空泡和速殖子数量均少于ARM-Lip组(t=-0.500、-0.057,均P＜0.01).结论 ARM-Lip具有较好的安全性,在体外可抑制弓形虫速殖子的增殖,但效果不及SDZ.