目的:明确1例联合氧化磷酸化缺乏症28型（COXPD28）患者的致病基因突变，初步探索其致病机制。方法:回顾性分析2019年8月就诊于山东省立医院集团东营市人民医院1例COXPD28患者的临床特征。通过线粒体基因测序与全外显子组测序明确其致病基因突变，构建致病基因野生型及突变型质粒，通过实时荧光定量PCR与免疫印迹实验评估突变基因对蛋白表达的影响。统计学方法主要采用单因素方差分析及LSD检验。结果:患者女性，21岁，因自幼反复胸闷、憋喘就诊，主要表现为乳酸酸中毒。全外显子组基因测序发现溶质载体家族25成员26（SLC25A26）基因存在复合杂合突变（c.34G>C，p.A12P；c.197C>A，p.A66E），查询HGMD数据库，为国内首次报道。体外功能试验证实：与转染野生型质粒相比，细胞转染SLC25A26基因突变质粒后SLC25A26 mRNA及S-腺苷甲硫氨酸载体（SAMC）蛋白表达水平均显著降低，其中p.A66E突变质粒可使SLC25A26 mRNA及SAMC蛋白表达水平分别降为野生型质粒的6%与26%（ P值均<0.001），而p.A12P突变质粒则分别降为野生型质粒的62%与82%（ P<0.001， P=0.044）；双突变（p.A66E+p.A12P）质粒共转染时，SLC25A26 mRNA与SAMC蛋白表达水平分别降低为野生型质粒的47%与57%（ P<0.001， P=0.001）。 结论:本例COXPD28患者的致病突变基因为SLC25A26基因突变（p.A66E、p.A12P），该突变导致SLC25A26表达水平降低，造成线粒体氧化磷酸化功能障碍，诱发COXPD28。

目的 探究脂蛋白1(lipin1,LPIN1)对帕金森病(Parkinson's disease,PD)模型大鼠病情进展的影响及其调控的可能分子机制.方法 采用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA)注射大鼠单侧的内侧前脑束构建PD大鼠模型,并稳定转染LPIN1过表达腺病毒,评估大鼠行为学变化;检测大鼠脑组织中Fe2+和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量及酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白水平;HE染色观察大鼠脑组织病理变化.构建体外PD细胞模型,检测细胞中TH,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn),LPIN1蛋白水平及细胞活力;转染LPIN1小干扰siRNA序列和过表达载体及过氧化物酶增殖物激活受体A(peroxisome proliferator-activated receptor A,PPARA)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和过表达载体,或用铁死亡诱导剂Erastin处理细胞24 h,后用6-OHDA 处理细胞 48 h.检测各组细胞中 Fe2+含量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、GSH和炎症因子水平以评估铁死亡;CCK-8检测细胞增殖活力,Western blot法检测铁死亡相关蛋白表达.通过STRING数据库预测LPIN1的互作蛋白PPARA,利用Co-IP分析进行验证;JASPAR生物信息学网站预测PPARA与溶质载体蛋白家族47成员A1(solute carrier family 47 member 1,SLC47A1)启动子的结合位点,利用Ch-IP分析进行验证.结果 模型组大鼠皮毛悚立,表现出身体持续震颤、动作迟缓、活动能力减弱等PD症状;LPIN1组大鼠运动行为及PD症状较模型组改善/减轻.与假手术组相比,模型组大鼠运动总路程缩短、平均速度降低、步长减小、总静止时间延长、步宽增宽、步态变异率增大,差异具有统计学意义(t=6.816,7.026,26.556,7.454,8.503,7.971,均P＜0.05);模型组大鼠脑组织中Fe2+含量升高,GSH含量及TH蛋白表达降低,差异具有统计学意义(t=8.305,13.305,7.709,均P＜0.05).LPIN1组大鼠行为学评估、各指标水平及脑组织病理改变较模型组明显改善/减轻.6-OHDA呈剂量依赖性降低PC-12细胞活力及TH,LPIN1蛋白水平,升高α-syn蛋白水平,差异具有统计学意义(F=31.023,7.350,9.124,15.841,均 P＜0.05).沉默 LPIN1 加剧了 6-OHDA 对 PC-12 细胞活力的抑制作用(t=2.209,P＜0.05),过表达LPIN1 则可抵消 6-OHDA 的作用(t=4.989,P＜0.05).过表达 LPIN1 降低 IL-1β,IL-6 分泌,升高 SLC47A1 和 GPX4蛋白水平,降低Fe2+,MDA含量和ROS水平,升高GSH含量(t=3.013～11.639,均P＜0.05);Erastin可逆转LPIN1过表达对铁死亡的抑制作用,降低PC-12细胞活力(t=3.087～7.581,均P＜0.05).LPIN1与PPARA蛋白互作并促进PPARA表达,PPARA与SLC47A1启动子结合并促进SLC47A1转录激活.过表达PPARA可抵消LPIN1沉默对PC-12细胞的影响.结论 过表达LPIN1可能通过抑制PPARA/SLC47A1轴介导的铁死亡,减少神经元细胞凋亡,进而缓解PD模型大鼠的病情进展.

目的 探讨建立阿米卡星(AKN)体外肾损伤模型的方法,研究在AKN体外肾损伤模型中王不留行黄酮苷(VA)的保护作用及机制.方法 体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),孵育不同浓度的 AKN或 VA,MTT法检测细胞活力,确定药物浓度;采用二氢乙锭(DHE)探针和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)检测试剂盒检测细胞内氧化应激状态的变化;提取总RNA,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肾损伤分子-1(KIM-1)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因表达的变化;提取总蛋白,Western blot检测铁死亡相关的蛋白溶质载体蛋白家族47 成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4)的水平.结果 高浓度AKN在体外可以显著引起 HK-2 细胞活力的下降,AKN对HK-2 细胞的半数抑制浓度(IC50)为(5.74±0.47)mmol/L.25～100 μmol/L的VA可以提高AKN刺激后的HK-2 细胞活力(P<0.05).AKN(4 mmol/L)处理后,KIM-1 和NGAL的mRNA表达水平显著高于阴性对照(NC)组(P<0.001);VA(50 μmol/L)可以显著降低KIM-1(P<0.01)和NGAL(P<0.05)的mRNA表达水平.AKN处理 3h后DHE染色强度升高但差异无统计学意义,6～24 h后DHE染色强度显著大于0h组(P<0.01).此外,AKN处理6～24h后MDA水平显著上升,GSH水平显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05).AKN刺激6～24h后,铁死亡相关蛋白SLC7A11 和GPX4 表达均明显下降(P<0.001).VA同时孵育 24 h,显著逆转DHE染色、GSH和MDA水平的变化及SLC7A11 和GPX4 蛋白的下降(P<0.001).结论 该研究通过高浓度AKN体外刺激HK-2 细胞建立AKN体外肾损伤模型,并发现VA可能通过抑制过氧化应激相关的铁死亡途径减轻AKN导致的肾小管细胞损伤.

目的 探讨基于网络药理学和分子对接技术的小儿黄龙颗粒治疗注意缺陷多动障碍(ADHD)的作用机制.方法 计算机检索TCMSP数据库,筛选小儿黄龙颗粒的活性成分和对应靶点;检索DisGeNET,GeneCards,TTD,DrugBank,ADHDgene数据库,筛选ADHD相关靶点;利用Venny 2.1平台对小儿黄龙颗粒活性成分靶点与ADHD靶点取交集,获取共有靶点即为小儿黄龙颗粒治疗ADHD的潜在作用靶点.利用String数据库构建小儿黄龙颗粒治疗ADHD潜在作用靶点的蛋白互作网络(PPI),采用Cytoscape 3.8.0软件分析网络中的核心靶点.采用Metascape数据库进行GO富集分析和KEGG通路富集分析.采用AutoDockTools 1.5.6软件进行分子对接研究,以结合能<-4.25 kcal/mol为受体、配体间有一定的结合活性.结果 共获得小儿黄龙颗粒的活性成分47种,靶点163个;ADHD靶点1115个;小儿黄龙颗粒治疗ADHD的潜在作用靶点55个.豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素是小儿黄龙颗粒治疗ADHD的关键成分.PPI分析结果显示,白细胞介素6(IL-6)、蛋白激酶1(AKT1)、雌激素受体1(ESR1)、溶质载体家族6成员4(SLC6A4)、肾上腺素能受体β2(ADRβ2)和烟碱型胆碱受体α7(CHRNα7)6个靶点为小儿黄龙颗粒治疗ADHD的核心靶点.GO富集分析主要涉及突触传递、细胞对有机环状化合物及含氮化合物的反应等生物过程,突触后膜、树突、膜筏等细胞组分,神经递质受体活性、G蛋白偶联胺受体活性及单加氧酶活性等分子功能.KEGG通路富集分析主要涉及神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路、环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(cGMP/PKG)信号通路、胆碱能突触信号通路等.分子对接结果显示,核心靶点与其对应的关键成分结合能均小于-4.25 kcal/mol.结论 小儿黄龙颗粒治疗ADHD具有多成分、多靶点、多通路的特点.