目的:优选出不同状态(新鲜、干燥)及不同药用部位的不同药用植物(滇重楼、密脉鹅掌柴、铁皮石斛)最适宜的制片方法,提高横切面组织装片制备效率.方法:采用不同防冰晶形成保护剂(不处理、蔗糖和甘油)处理新鲜材料并进行冰冻切片,采用甘油软化干燥材料并进行石蜡切片,比较不同前处理条件和两种制片方法的制片效果.结果:新鲜材料中,密脉鹅掌柴的茎叶,滇重楼的根茎、茎、叶采用甘油溶液做保护剂效果较佳,而铁皮石斛适用蔗糖磷酸缓冲溶液做保护剂;滇重楼的须根用石蜡切片法可获得组织结构完整的装片.此外,经甘油溶液软化,滇重楼的干燥根茎和密脉鹅掌柴的干燥叶可获得质量较好的石蜡切片.结论:质地稍硬的新鲜药材用甘油溶液处理后采用冰冻切片可以获取较为理想的效果;质地柔软的新鲜药材可不经任何处理或经蔗糖磷酸缓冲液浸泡后采用冰冻切片;干燥药材或含淀粉类药材采用石蜡切片法可获得理想的切片效果.

目的 建立重楼及其混伪品的近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIRS)快速鉴别方法.方法 采用NIRS仪获取样品光谱数据,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)、线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)、人工神经网络机器学习算法(artificial neural network,ANN)和二维红外光谱(2D-IR),探讨NIRS技术在重楼及其混伪品快速鉴别的可行性.结果 重楼及其混伪品的NIRS光谱吸收峰的峰形整体相似,但在峰数和峰强方面均存在一定差异.PCA和OPLS-DA判别模型可将重楼及其混伪品区分,但模型预测能力差(Q2＜0.5);LDA 模型可将滇重楼与其他物种进行区分,但无法区分七叶一枝花的部分样本;ANN模型识别准确率达 100.0%,不同物种的 2D-IR图谱在 5 897～5 600 cm-1 和 4 497～4 200 cm-1 差异显著.结论 重楼及其混伪品的化学信息差异明显,不可混用.NIRS结合ANN模型或 2D-IR方法可用于重楼及其混伪品的快速鉴别.

目的 建立一测多评法(quantitative analysis of multi-components by a single marker,QAMS)与 HPLC 指纹图谱及化学计量分析相结合的方法对滇重楼及其近缘种的质量进行评价.方法 建立滇重楼及其近缘种的指纹图谱并进行相似度分析、聚类分析(cluster analysis,CA)以及主成分分析(principal component analysis,PCA).以重楼皂苷Ⅶ为内标,建立重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷H、重楼皂苷D、伪原薯蓣皂苷的相对校正因子,并考察QAMS的可行性.色谱条件:采用Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(4.6 mm × 250.0 mm,5 μm);乙腈(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱;流速0.8 mL/min;柱温30℃;检测波长203 nm;进样量5 μL.结果 建立了不同种重楼样品的指纹图谱,相似度分析显示不同种重楼样品的相似度介于0.646～0.913,表明不同种重楼间的化学成分及含量差异性较大;以重楼皂苷Ⅶ为内标,所建立的滇重楼QAMS含量测定方法,与外标法(external standard method,ESM)得到的结果进行比较无显著差异,确定了 QAMS在含量测定中的可行性,将QAMS应用于滇重楼近缘种的含量测定,只有长柱重楼的全部样品(CZCL01～04)和TCCL03符合《中华人民共和国药典》的质控标准;进一步以重楼样品中的8个皂苷类成分的峰面积作为变量进行聚类分析和主成分分析,聚类分析结果显示滇重楼及其近缘种样品可以聚为4类,长柱重楼、大理重楼和腾冲重楼均可自成一类,其余种重楼无法进行区分.主成分分析中46批重楼样品大体可以分为5类,大理重楼、长柱重楼、腾冲重楼各为一类,大部分滇重楼为一类,毛重楼、矮重楼、独龙重楼样品在主成分分析中无分类趋势.结论 QAMS与指纹图谱及化学计量分析相结合的方法可以完成对滇重楼及其近缘种中8种皂苷类成分的同时快速定量.并对其质量进行评价.实验建立的分析方法准确可行,可以在保护中药资源、节省时间的前提下对滇重楼及其近缘种样品的质量进行综合评价.

目的:研究滇重楼须根在自然腐解条件下对其根际土壤养分、微生物数量和土壤酶活性的影响.方法:以四年生和五年生滇重楼幼苗为试验材料,在供试土壤中加入不同剂量的滇重楼须根,研究它们腐解对根际土壤理化性质、微生物数量和土壤酶活性的影响.结果:滇重楼须根自然腐解会抑制根系活力、丛枝菌根真菌侵染强度以及总提取球囊霉素和易提取球囊霉素含量,降低根际土壤pH值、速效氮(AN)、速效磷(AP)和有机质(OM)含量以及磷酸酶和脲酶活性,减少细菌、放线菌和总微生物数量,增加真菌数量和蔗糖酶活性,随着须根施用量的增加,上述指标的减少或增加幅度逐渐增加.相关分析发现,脲酶活性与土壤pH、AN、AP和OM含量之间均呈显著正相关,这说明其活性可作为表征滇重楼连作土壤理化性质变化的重要指标.结论:人工种植滇重楼过程中遗留须根自然腐解显著改变滇重楼根际土壤理化性质可能是造成连作障碍的重要因素之一,实际生产中避免须根遗留是保障滇重楼生长发育及品质形成的有效措施.

目的:研究不同丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼产量和品质的影响,为筛选滇重楼的优良AM真菌株提供科学依据.方法:以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜根茎与28种AM真菌共同培养后采样,选取浸泡于FAA固定液中滇重楼根系30条,采用Philips J M等的方法染色、制片、镜检,根据Trouvelot等的方法统计菌根侵染率,以及用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎中核苷(胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2'-脱氧腺苷)和碱基(尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤)的含量.结果:多数处理组滇重楼AM真菌侵染率均有所提高,其中Ga、Asc和Asp处理组的浸染率最显著(P<0.05);不同AM真菌对滇重楼根茎中核苷和碱基含量的影响有所差异;滇重楼根茎中核苷和碱基的积累可能同时存在协同和竞争2种效应.结论:施加外源AM真菌对滇重楼根内AM真菌的侵染率具有调控(增减)作用,在人工栽培过程中接种Sde、Gd、Sca、Spe、Svi、Pb等6种优势AM真菌,能有效促进滇重楼的品质.

探究野生和栽培产地滇重楼根际土壤中16种无机元素的5种化学形态分布规律及其与药材品质的相关性,为滇重楼科学化种植及药效功能的开发利用提供参考依据.采用BCR顺序提取法提取不同化学形态的无机元素,采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行元素含量测定,再利用SPSS软件进行相关性分析.滇重楼的野生品和栽培品的根际土壤中16种无机元素主要以残渣态为主,且野生品和栽培品在各元素含量方面差异明显,栽培品高于野生品;Ca、Mg元素在水溶态和交换态中的含量明显高于其他元素,P、Mo元素含量则较低;Ca、Mg、Fe、Al元素在有机态和铁锰氧化态中的含量明显较高,但Na元素未检测出;相关性分析表明,滇重楼中重楼皂苷的积累与根际土壤中的P、K元素呈显著的负相关关系,与Fe、Al、Se、Ba等元素呈显著正相关关系.综上,滇重楼根际土壤中的无机元素大部分以残渣态形式存在,P、K元素的存在在一定程度上抑制了重楼皂苷的积累,Fe、Al、Se、Ba等元素促进了重楼皂苷的积累.

目的 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS法结合网络药理学研究滇重楼抗肺癌活性成分.方法 滇重楼70％甲醇提取物的分析采用ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);流动相0.1％甲酸-乙腈;体积流量0.3mL/min;电喷雾(ESI)离子源;负离子模式.通过网络药理学预测活性成分作用靶点、疾病相关靶点、成分-疾病-靶点相互关系,筛选调控疾病靶点的关键成分和相关作用靶点,并得到相关的调控通路.结果 滇重楼提取物中共鉴定出26个化合物,包括17个异螺甾烷醇型(9个薯蓣皂苷型、8个偏诺皂苷型)、1个螺甾烷醇型、1个C21甾体化合物、2个黄酮类、1个其他类.活性成分进行靶点预测,与肺癌共性靶点91个.活性成分-靶点网络和肺癌靶点PPI网络分析表明,dioscinin、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷V为滇重楼治疗肺癌的关键成分.重楼治疗肺癌KEGG分析发现,PI3K-Akt、Ras、MAPK等信号通路,为重楼活性成分调控肺癌的主要信号通路.结论 本研究明确了重楼抗肺癌的关键活性成分、相关调控通路,为滇重楼抗肺癌新药的研制提供理论基础.

目的 研究须根腐解对滇重楼根际土壤和根茎中无机元素的影响,为滇重楼连作障碍形成机制提供理论支持.方法 采用凯氏定氮法和电感耦合等离子体质谱法测定滇重楼根际土壤和根茎中N、P、K等23种无机元素的含量.结果 与空白组比较,滇重楼须根腐解产物抑制了根际土壤中大量营养元素(N、P、K)、微量营养元素(Ca、Mg、Fe、Na、Ba、Se、Co、Mn)和重金属元素(Cu、Pb、As)的含量,而增加了根际土壤中Cr、Cd、Hg的含量.随着滇重楼须根施用的增加,根茎内P、Ca、Fe、Zn、Pb的含量减少,Mg、Na、Se、Co、Mn、Al、Cr、Cu、As、Hg的含量增加,根茎内K含量未发生显著变化,未检测到N含量.相关分析发现:有70对无机元素在滇重楼吸收无机元素的过程中起到了积极的促进作用.结论 人工种植滇重楼过程中需要合理搭配各种无机元素肥料来改善滇重楼的药材质量.

该研究从滇重楼中克隆得到糖基转移酶基因PpUGT2,该基因ORF长度为1773 bp,编码蛋白质的氨基酸为590个.系统进化树分析显示,该糖基转移酶归为UGT80A亚家族,经国际糖基转移酶命名委员会命名为UGT80A49.构建原核表达载体pET28a-PpUGT2,通过诱导蛋白表达及蛋白提取,进行体外酶促实验,以UDP-葡萄糖为糖基供体,薯蓣皂素和偏诺皂素为底物,鉴定了其具有催化薯蓣皂素及偏诺皂素C-3 羟基β糖基化的功能,为进一步研究其催化特性,对其进行了底物宽泛性研究,以UDP-葡萄糖为糖基供体,共选取了包括甾体及三萜类化合物在内的15 个底物,发现其具有催化甾体类化合物睾酮C-17 羟基糖基化的功能.通过同源建模及分子对接,预测了PpUGT2与底物薯蓣皂素及偏诺皂素之间相互作用的关键识别位点.并且通过对配体与多肽的氨基酸扫描,模拟突变,根据复合物的结合亲和力变化,在以底物为中心的5 ?范围内,寻找到了最佳突变体,对突变体的设计具有参考意义.该研究为完整解析重楼皂苷生物合成途径以及甾体类糖基转移酶的结构研究奠定了基础.

目的 初步探索接种不同外源性丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis幼苗内源激素水平变化规律.方法 以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜种子与28种AM真菌共培养后采样,采用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎和须根内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的量.结果 接种外源性AM真菌能提高滇重楼幼苗菌根侵染率和成苗率,AM真菌对滇重楼幼苗根茎和须根中ZR、GA、IAA、ABA 4种激素量的变化表现出不同的规律,但具有偏好性.与对照组相比,整体上接种AM真菌处理组根茎中ZR、GA量呈现增长的趋势,IAA量变化规律不明显,而ABA量呈现减少的趋势,接种AM真菌处理组根茎中ABA/ZR、ABA/GA、ABA/IAA值呈现减少的趋势,但须根与根茎的变化趋势相反.结论 AM真菌能促进滇重楼幼苗的存活率,且不同AM真菌菌株影响滇重楼内源激素量.