猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题,该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究,为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障.采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响,利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子.结果表明,根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化,菌液浓度A600nm=0.6,受体材料猪苓菌丝,侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件;9 μg·mL-1潮霉素初筛和13 μg·mL-1潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件.经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析,结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达,在最优条件下,转化率可达到2.3％,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d.该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系,为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础.

AP2转录因子属于AP2/ERF超家族,参与调节植物生长发育的各种生物学过程,以及对生物和非生物胁迫的响应.然而,关于紫苏(Perilla frutescens)AP2转录因子家族的研究未见报道.在本研究中,从紫苏基因组中鉴定到18个AP2家族成员,使用生物信息学方法分析了基因结构、保守基序和顺式作用元件.WRINKLED 1(WRI1)是许多植物物种中脂质生物合成的关键调节因子,在油脂合成过程中发挥重要调控作用.通过序列比对发现其中1个成员与AtWRI1序列高度同源,含有2个保守的AP2结构域,命名为PfWRI1.结合转录物组数据分析了 PfAP2家族基因在紫苏不同组织和种子发育不同阶段的表达水平,结果表明,PfWRI1仅在紫苏种子中高表达,暗示Pf-WRI1 可能与种子的发育过程有关.进而构建植物过表达载体pCAMBIA1303-PfWRI1,通过农杆菌侵染技术转化野生型(Col)以及突变体(wri1-1)拟南芥,分别获得过表达和回补株系.结果表明,相比于Col,PfWRI1的表达导致拟南芥种子含油率提高了 8.90％～13.57％,并促进转基因拟南芥种子中油酸(C18:1)和亚油酸(18:2)的积累,减少棕榈酸(C16:0)、花生酸(C20:0)和花生一烯酸(C20:1)的积累.此外,外源PfWRI1基因的表达增加了糖酵解和脂肪酸生物合成相关基因At-PKP-α、AtPKP-β1、AtBCCP2、AtSUS2和AtLIP1的表达.综上所述,PfWRI1可能通过与上述基因互作,增加不饱和脂肪酸含量来促进油脂积累.

目的:研究热效应对生物陶瓷糊剂结合热凝牙胶垂直加压法在根管不同部位充填效果的影响。方法:将40颗单根管牙样本随机分为对照组、iRoot SP组、10 s组、20 s组，每组10颗。所有牙样本在去除牙冠后根管预备至0.04锥度。对照组行AH-plus糊剂结合热凝牙胶垂直加压充填；iRoot SP组行iRoot SP单尖充填；10 s组及20 s组使用iRoot SP单尖充填结合热凝牙胶垂直加压充填，并分别在使用热凝牙胶前以180 ℃分别加热10 s及20 s。使用亚甲基蓝染色法、扫描电子显微镜（SEM）观察法、牙科显微镜观察法分析充填后根管中上段和根尖1/3处的缝隙发生情况。结果:对于根尖1/3处的充填，10 s组和20 s组均无明显缝隙出现，且染料侵染深度与对照组之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。对于根管中上段的充填，iRoot SP结合单尖充填出现缝隙的概率较高。 结论:短时间的高温加热不会影响iRoot SP对于根尖1/3处的封闭效果；对于根管中上段，iRoot SP单尖充填结合热凝牙胶垂直加压法的充填效果优于iRoot SP单尖法充填。

目的:通过体外试验探究慢性淋巴细胞白血病细胞损害CD8 +T细胞的线粒体代谢功能影响嵌合抗原受体的T淋巴细胞(chimeric antigen receptors modified T cells，CAR-T)的效能。 方法:将培养得到的CAR-T细胞和CD8 +T细胞作为正常组，感染组为加入慢性淋巴细胞白血病细胞进行侵染的CAR-T细胞和CD8 +T细胞。采用FACScan流式细胞仪检测CAR-T细胞的凋亡情况；Western blot检测细胞凋亡相关的蛋白Bcl-2、cleaved-caspase-3和Bax的相对表达量；酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测炎症因子肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-6和IL-10的变化；使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度；化学发光发检测细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)水平，分光光度计检测线粒体丙二醛(malondialdehyde，MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量；荧光探针法检测胞内钙离子浓度的变化，实时荧光定量PCR检测线粒体DNA表达水平的变化。 结果:正常组CAR-T细胞凋亡率显著低于感染组CAR-T细胞凋亡率，差异有统计学意义[(4.58±0.16)%比(7.06±0.74)%， χ2＝5.674， P<0.05]。感染组的Bax和cleaved-PARP表达量明显高于正常组，Bcl-2表达量明显低于正常组，差异具有统计学意义[(3.51±0.01)%比(1.07±0.01)%，(2.34±0.05)%比(1.36±0.04)%，(0.66±0.02)%比(1.17±0.02)%， χ2值分别为298.838，26.509和31.231， P值均<0.05]。感染组的IL-6、TNF-α表达量较正常组明显升高，IL-10表达量较正常组明显降低，组间差异具有统计学意义[(87.69±21.07)ng/L比(43.25±5.36)ng/L，(65.12±15.75)ng/L比(33.14±5.23)ng/L，(16.02±1.69)ng/L比(24.33±2.33)ng/L， t值分别为3.54，3.338和4.988， P值均<0.05]。感染组的ATP和总钙离子浓度低于正常组，差异具有统计学意义[(0.15±0.03)μmol/g比(0.32±0.06)μmol/g，(12.46±2.74)μmol/L比(25.97±3.49)μmol/L, t值分别为4.389和5.274， P值均<0.05]。感染组的MDA含量高于正常组，GSH含量低于正常组，差异具有统计学意义[(1.84±0.23)μmol/L比(1.34±0.21)μmol/L，1.07±0.17)pg/mg比(5.23±0.36)pg/mg， t值分别为2.781和18.098， P值均<0.05]。感染组CD8 +T细胞线粒体基因蛋白的表达量明显低于正常组，差异具有统计学意义[(0.62±0.03)%比(1.01±0.06)%, χ2＝10.070， P<0.05]。 结论:离体状态下慢性淋巴细胞白血病细胞通过损害CD8 +T细胞的线粒体代谢功能促进CAR-T细胞的凋亡。

入侵杂草南美蟛蜞菊(Sphagneticola trilobata)的优势生长严重危害本土植物群落和生态系统的稳定性.近年来,化学防治依然是最主要的杂草防控手段.丛枝菌根真菌(AMF)作为一种菌根共生体,在宿主植物的生长和抵抗外界环境胁迫中起到重要的作用.该研究通过温室控制实验设置4种处理方式:对照组、只接种AMF、只喷施除草剂以及喷施除草剂并接种AMF,以验证AMF是否在入侵杂草南美蟛蜞菊响应除草剂中起到重要作用.结果显示:在草甘膦铵盐除草剂的胁迫下,南美蟛蜞菊的菌根侵染率、泡囊数以及菌根侵染丰度等级占比都显著上升;相比于只喷施除草剂处理,接种AMF显著增加南美蟛蜞菊的叶面积、地上生物量和根冠比,显著减少黄酮醇相对含量以及叶片损害数.首次发现与AMF的共生能缓解除草剂对入侵杂草南美蟛蜞菊的胁迫.因此,在杂草的化学防治过程中,与AMF的共生可能极大提高杂草对除草剂的抗性,可为入侵杂草的有效防控提供新的思考途径.

[目的]明确病毒侵染对滇黄精生长发育、根茎产量及品质的影响,为深入研究病毒的致病机理提供依据.[方法]以云南省滇黄精主产区曲靖和玉溪种植的4年生滇黄精田间抗病和感病植株为研究对象,比较病毒侵染后滇黄精叶绿体超微结构、叶片光合气体交换参数、叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物氧化酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)以及块茎生物学性状和药用有效化学成分含量的变化.[结果](1)滇黄精遭受病毒侵染后,叶片细胞质中散布线状病毒粒子及其聚集形成的大量内含体,细胞内叶绿体结构严重受损,部分已发生解体;(2)感病滇黄精叶绿素发生降解,叶绿素a和b的含量分别极显著降低了 22.97％和35.38％,其叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度分别降低了 49.75％、11.25％和5.79％,光合作用效率明显减弱;(3)感病滇黄精叶片细胞膜发生强烈的脂膜过氧化反应,MDA含量升高了 117.17％,SOD、POD、PPO、PAL活性极显著升高,其中PPO活性平均升高了 61.81％;(4)感病滇黄精地下根茎的膨大和嫩芽的生长受阻,单株鲜质量降低了49.47％,根茎中多糖的相对含量减少了 6.97％,皂苷、黄酮、总酚含量分别减少了 23.31％、15.32％、11.07％.[结论]滇黄精遭受病毒侵染后,抗氧化酶防御反应虽然被激活,但细胞膜仍严重受损,光合作用明显减弱,最终导致根茎产量和药用品质显著降低.

目的 探讨棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)中Y盒蛋白 3(Y-box binding protein 3,YBX3)水平对小鼠产热和能量消耗的影响作用机制.方法 将小鼠置于 4℃环境作为冷刺激方法.用慢病毒侵染法构建过表达YBX3 或者抑制YBX3 表达的人血管基质组分细胞系.测量细胞的耗氧率用于评估细胞的线粒体功能.向小鼠BAT注射YBX3 的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)构建抑制小鼠BAT中YBX3 表达的模型.检测小鼠的O2 消耗速率、CO2 释放速率和能量消耗速率用于评估小鼠能量代谢情况.采用qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光染色法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子 1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α,PGC-1α)、解偶联蛋白 1(uncoupling protein 1,UCP1)和YBX3 基因的表达.采用苏木精-伊红法染色检测BAT中脂肪细胞脂滴大小.采用RNA结合蛋白免疫沉淀提取与YBX3 特异性结合的mRNA.采用二代测序方法鉴定 mRNA.采用双荧光素酶报告基因系统检测 YBX3 与目的序列结合的情况.结果 在寒冷刺激下野生型小鼠BAT中YBX3 的表达显著增加(P<0.05).过表达YBX3 的人血管基质组分细胞系诱导为成熟棕色脂肪细胞后可以促进产热基因PGC-1α和UCP1 的表达(P<0.05).抑制YBX3 表达的人血管基质组分细胞系诱导为成熟棕色脂肪细胞后可以抑制PGC-1α和UCP1 的表达(P<0.05)、抑制线粒体氧化磷酸化(P<0.05).与对照组相比,小鼠注射si-Ybx3 之后能量消耗显著降低(P<0.05),在寒冷环境难以维持体温(P<0.05),产热基因表达被显著抑制(P<0.01),BAT中脂肪细胞脂滴大小显著增加(P<0.05).与在 25℃相比,4℃环境刺激下BAT中YBX3 在细胞核中的表达显著增加(P<0.05).YBX3 能够特异性地与PGC-1αmRNA 3'非翻译区特定位点相结合(P<0.05).YBX3 能够特异性地与 PGC-1α 和 UCP1 启动子区域相结合(P<0.05).结论 BAT中YBX3 能够通过调控PGC-1α和UCP1 的表达影响产热和能量代谢.

目的:通过分析新型抗肿瘤药物维奈克拉(VEN)的药物不良事件(ADE)信号,为其临床安全合理用药提供参考.方法:利用OpenFDA公共数据开放项目检索药物不良事件报告系统(FAERS)数据库 2016 年 4 月至 2023 年 3 月维奈克拉的不良反应数据,采用报告比值比(ROR)法、英国药品和保健产品管理局(MHRA)综合标准法、贝叶斯可信区间递进神经网络(BCPNN)法、多项式伽马泊松分布缩减(MGPS)法挖掘和分析维奈克拉的ADE信号.结果:在从FAERS数据库收集的 29 849 份报告中,确定了 336 份维奈克拉相关ADE报告,共累及 27 个系统器官分类(SOC).发生例数较多的SOC依次为全身性疾病及给药部位各种反应,各类检查,感染及侵染类疾病,各类损伤、中毒及操作并发症,胃肠系统疾病、血液及淋巴系统疾病等.排除原发病本身因素及与药物无关的不良反应,常见的ADE主要包括血小板计数降低,感染性肺炎,发热等.严重的ADE(如:住院、死亡和危及生命)发生率较高.同时新发现维奈克拉说明书中未提及的可疑ADE有COVID-19、心房颤动、胸腔积液、真菌性肺炎等.结论:本研究结果与临床试验一致,同时还发现了维奈克拉潜在的新的ADE信号.本研究结果可为维奈克拉的临床使用及进一步安全性研究提供有价值的证据.

[目的]筛选玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)转录因子的互作蛋白,解析黑色素调控转录因子StMR1 调控玉米大斑病菌致病性的分子机制.为解析玉米大斑病菌侵染过程中转录因子的调控网络,阐明病菌的致病机理提供参考.[方法]收集玉米大斑病菌菌丝和孢子不同萌发阶段作为试验材料,采用Gateway方法构建玉米大斑病菌cDNA文库,使用同源重组的方法构建转录因子StMR1 的诱饵载体,采用酵母双杂交技术筛选其互作蛋白并进行一对一验证.[结果]构建的玉米大斑病菌文库插入的平均片段长度大于 1 000 bp,初级文库及次级文库的库容量为 1.2×107 和 1.04×107 CFU,重组率为 100%,可以用于酵母双杂交筛选.成功构建可以用于筛库的诱饵载体pGBKT7-StMR1,经初筛与复筛得到 3 个互作蛋白,一对一验证短链脱氢酶、糖基转移酶、富含亮氨酸重复序列蛋白均与转录因子StMR1 存在互作.[结论]成功构建了丰富度高且质量好的玉米大斑病菌cDNA文库并筛选到了与转录因子StMR1 互作的蛋白.

目的 基于衔接蛋白DAP12 的多链嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)开发靶向 CD30 的 CAR-T 细胞药物,研究CD30 CAR-T对霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞的体外和体内临床前药效.方法 通过基因合成和分子克隆技术,设计构建靶向CD30 的CAR质粒,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染T细胞,其中靶向 CD30 的多链 CAR-T 为 CD30-KIRS2/Dap12-BB组,单链二代CAR-T为CD30-41BBζ组,未做病毒侵染的T细胞为NTD组,利用流式细胞术检测CAR阳性率情况,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放检测细胞的杀伤活性,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子干扰素γ(IFN-γ)的分泌水平,进一步通过小鼠异种移植瘤模型检测CD30 CAR-T在小鼠体内抗肿瘤活性.结果 靶向CD30 的多链CAR-T和单链二代 CAR-T进行对比,研究发现多链CAR-T与单链 CAR-T 的杀瘤作用相似.但值得注意的是,多链CAR-T 的IFN-γ 分泌水平更高(P<0.001).更重要的是,在小鼠的肿瘤模型实验中,多链 CAR-T 实现了肿瘤的完全消退.结论 靶向CD30 的多链CAR-T在抗肿瘤活性方面优于传统单链CAR-T.